本发明专利技术涉及一种MTRR基因多态性检测引物以及采用该引物的检测体系和试剂盒，包括针对MTRR基因c.66位点为A情况的正向引物、针对MTRR基因c.66位点为G情况的正向引物、对应MTRR基因c.66位点的反向通用引物、检测β-actin基因的正向引物和检测β-actin基因的反向引物；针对MTRR基因c.66位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；针对MTRR基因c.66位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；对应MTRR基因c.66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；检测β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；检测β-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本发明专利技术的MTRR基因多态性检测试剂盒检测快速方便，灵敏度高，准确率高，成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物
技术介绍
叶酸代谢途径中的关键酶基因如甲硫氨酸合成还原酶（Methionine synthase reductase，MTRR)基因、亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)基因突变会导致叶酸利用能力下降、DNA遗传稳定性降低，从而导致胚胎发育异常 如神经管缺陷、唇腭裂、先天性心脏病、Down综合征等；并使妊娠期高血压和习惯性流产风 险增加。 甲硫氨酸合成还原酶（MTRR)是一种黄素蛋白相关的酶，能维持甲硫氨酸合成酶 的活性状态，对维持体内蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸一一甲硫氨酸的循环起重要 的调节作用。甲硫氨酸的合成是由甲硫氨酸合酶（MTR编码）催化的，而甲硫氨酸合酶因为 辅助因子维生素 B12被氧化而最终失活；MTRR编码的甲硫氨酸合成还原酶能够通过还原型 甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺 乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。较常见的人类MTRR 基因多态性66A - G，使蛋氨酸被异亮氨酸替代，酶活性显著降低，导致体内同型半胱氨酸 堆积。MTRR基因检测是叶酸利用能力评估的关键项目，其检测结果为个体化（差异化）增 补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供科学依据。 目前进行MTRR基因多态性检测的方法主要有芯片技术、探针引物技术、酶切、焦 磷酸测序技术和HRM分析技术等，价格贵、繁琐或准确性不高。因此，开发一种检测MTRR基 因多态性的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的MTRR基因多态性检测是非 常有必要的。
技术实现思路
本专利技术公开了一种检测快速方便，灵敏度高，准确率高的MTRR基因多态性检测试 剂盒，以及其检测引物和检测体系。 本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTRR基因多态性检测 引物包括针对MTRR基因 c. 66位点为A情况的正向引物、针对MTRR基因 c. 66位点为G情 况的正向引物、对应MTRR基因 c. 66位点的反向通用引物、检测β-actin基因的正向引物 和检测β -actin基因的反向引物；所述针对MTRR基因 c. 66位点为A情况的正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述针对MTRR基因 c. 66位点为G情况的正向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述对应MTRRc. 66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述检测β -actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所 述检测β -actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。 各引物在反应体系中的终浓度为0. 4 μ M。 本专利技术为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测引物的 MTRR基因多态性检测试剂盒。 本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTRR基因多态性检测 体系，包括用于检测MTRR基因 c. 66位点为A情况的PCR反应体系A，用于检测MTRR基因 c. 66位点为G情况的PCR反应体系B，以及用于检测β -actin基因作为内对照的PCR反应 体系C ;所述PCR反应体系A包括针对MTRR基因 c. 66位点为A情况的正向引物、对应MTRR 基因 c. 66位点的反向通用引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系B包括 针对MTRR基因 c. 66位点为G情况的正向引物、对应MTRR基因 c. 66位点的反向通用引物、 SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系C包括检测β -actin基因的正向引物、 检测β -actin基因的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述针对MTRR基因 c. 66 位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述针对MTRR基因 c. 66位 点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述对应MTRR c. 66位点的反 向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述检测β-actin基因的正向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述检测β-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。 各PCR反应体系的体积为10 μ 1 ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是5 μ 1，各 引物的终浓度为0. 4 μ Μ，所述DNA模板的使用浓度为10~50ng/ μ 1，其余为纯水。 上述SYBR Green混合液是两倍浓度的SYBR Green混合液。本专利技术为解决上述技 术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测体系的MTRR基因多态性检测试剂盒。 本专利技术为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述的检测体系 的结果判定方法，具体步骤如下： 第一步，采用PCR反应体系C检测样本的β-actin基因， 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测； 若样本扩增CT值在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断； 第二步，采用PCR反应体系A和B分别检测该样本， 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两个CT差值的绝对值< 2 时，样本判断为杂合基因型；当两个CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所 对应的等位基因纯合型；当两个CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测； 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,则结果判断为不可信， 重新制备样本进行检测。 本专利技术具有积极的效果： (1)本专利技术的MTRR基因多态性检测试剂盒，首创将等位基因特异PCR结合SYBR Green的检测策略应用于检测人MTRR基因 c. 66位点的多态性，具有检测快速方便，灵敏度 高，准确率高的特点，应用范围极广。 (2)本专利技术的MTRR基因多态性检测试剂盒的检测结果与测序-结果进行比对，基 因型符合率彡99%，分子分型准确度高。 (3)本专利技术的MTRR基因多态性检测试剂盒突破了现有常规检测手费时费力且花 费不菲的应用局限，特别地，巧妙取代花费甚高且制备过程繁琐的传统荧光探针检测方法， 使成本极大降低，其操作和设计的简便性及对仪器的普适性，使之利于推广应用，从而使得 MTRR基因多态性检测在批量检测中有更广泛的应用领域，能更迅速地获得分子检测结果， 使得个性化医疗过程更为顺畅。【附图说明】 图1采用实施例1的试剂盒检测样本1的扩增曲线； 图2采用实施例1的试剂盒检测样本2的扩增曲线； 图3采用实施例1的试剂盒检测样本3的扩增曲线。【具体实施方式】 下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种MTRR基因多态性检测引物，其特征在于：包括针对MTRR基因c.66位点为A情况的正向引物、针对MTRR 基因c.66位点为G情况的正向引物、对应MTRR 基因c.66位点的反向通用引物、检测β‑actin基因的正向引物和检测β‑actin基因的反向引物；所述针对MTRR基因c.66位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述针对MTRR基因c.66位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述对应MTRR基因c.66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述检测β‑actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述检测β‑actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，张长顺，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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