本发明专利技术公开了一种用于通过RPA技术检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术还公开了用于牛病毒性腹泻病毒检测的试剂盒。采用本发明专利技术的引物和探针进行检测，仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行该病的诊治。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术(Lateral Flow Assay)检测牛病毒性腹泻病毒所用的引物和探针组合及其试剂盒。
技术介绍
牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV)引起的牛病毒性腹泻粘膜病，是牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床上以发热、腹泻、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染与免疫耐受、免疫抑制、怀孕母牛流产、产死胎和畸型胎以及致死性粘膜病为主要特征。该病呈世界性分布，感染情况复杂，持续性感染个体症状隐蔽，动物带毒率高，特别是BVDV严重影响感染动物的繁殖，给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。因而被世界动物卫生组织(OIE)列为发病必须上报的动物传染病之一。目前检测BVDV的主要方法有病毒分离、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、血清中和试验、电镜检查等，但这些方法不仅操作繁琐复杂、耗时耗力，而且难以用于BVDV的现场诊断。因此，亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为该病的现场诊断提供新一代的检测技术与手段。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是不同于PCR的核酸检测技术，主要有结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶三种酶参与。其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形成复制所需的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补链，对模板上的目标区域进行指数式扩增。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在RPA扩增体系中加入一个生物素标记的反向引物和5’荧光标记的探针，探针标记的荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点是DNA修复酶作用的底物，可被核酶nfo识别切割，产生新的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，从而使双标信号与扩增产物的累积同步，检测结果可在抗FAM金标结合和抗生物素捕获抗体的侧流层析试纸条上显示。目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，且国内外还没有将侧流层析RPA技术应用于BVDV检测的报道。本专利技术系首次采用RPA结合侧流层析技术建立快速检测BVDV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BVDV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
技术实现思路
针对RPA侧流层析技术应用于BVDV临床现场快速检测领域的优点，本专利技术提供了一种准确、快速、简便检测BVDV的RPA检测方法。仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行牛病毒性腹泻病毒的诊治。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种用于通过RPA技术检测BVDV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。正向引物：5’-CCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGAC-3’；(SEQ ID No.1)反向引物：5’-【Biotin】CAATACAGTGGGCCTCTGCAGCACCCTATCAGGC-3’；(SEQ ID No.2)探针序列：5’-【FAM】CTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCA【dSpacer】AGCACATCTTAACCTG【C3-spacer】3’(探针5’-端用FAM标记，距离5’-端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断)。(SEQ ID No.3)需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本专利技术的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。本专利技术还提供了一种检测BVDV的试剂盒，该试剂盒中包含有用于通过RPA技术检测BVDV的引物和探针组合。进一步的，该检测试剂盒中还包括有：BVDV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水和侧流层析检测试剂。BVDV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水与引物和探针组合一起构成RPA扩增体系。所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、280mM醋酸镁(MgAc)溶液。所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液(1×PBS+0.1％Tween20)。所述BVDV阳性对照模板的制备方法为：分别在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对的上游和下游设计引物:上游引物:5’-agtggtgagttcgttggatggc-3’(SEQ ID No.4)；下游引物:5’-catgtgccatgtacagcagaga-3’(SEQ ID No.5)；以BVDV基因组cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL：10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、LA Taq 0.5μL(5U/μL)、模板2μL，10μmol/L的上下游引物各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为：94℃预变性3min，然后进入94℃30s，55℃30s，72℃40s，共进行31个循环；72℃延伸10min，最后停止于4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体(该载体为常规的载体，商业化购买到)，蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对，正确的重组质粒为BVDV阳性对照模板。具体的，一种检测BVDV的试剂盒，每50μL RPA扩增体系中含有正向引物、反向引物各2.1μL(10μmol/L)，探本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于通过RPA技术检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针组合，其特征在于，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于通过RPA技术检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针组合，其特征在于，其正
向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3
所示。
2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备检测牛病毒性腹泻病毒的检测试剂中的应用。
3.一种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的
引物和探针组合。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：BVDV阳性对照模板、
RPA扩增试剂、去离子水和侧流层析检测试剂。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲
液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白和醋酸镁溶液。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析
试纸条和杂交检测缓冲液。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述醋酸镁溶液的浓度为280mM。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，扩增体系为50μL，向含有冻干酶粉的0.2mL ...
【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，侯佩莉，王洪梅，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。