本发明专利技术属于基因工程领域，公开了一种利用重组大肠杆菌生产顺式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，该重组大肠杆菌由如下方法构建：对已知的L-脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因序列进行优化，再全基因合成优化后的L-脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因，然后将该基因连接到含有合适启动子的载体上，构建了可过量表达L-脯氨酸-顺式-4-羟化酶的重组质粒，再将该重组质粒导入大肠杆菌中，得到能够将游离的L-脯氨酸转化为顺式-4-羟基-L-脯氨酸的重组大肠杆菌。本发明专利技术还公开了所述重组大肠杆菌在生产顺式-4-羟脯氨酸中的应用，摇瓶发酵结果表明，本发明专利技术的重组大肠杆菌的顺式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达到47.33mg/L。
【技术实现步骤摘要】
利用重组大肠杆菌生产顺式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)为亚氨基酸，是脯氨酸羟基化后的产物，根据其羟基化位置及空间结构的不同，共有8种异构体。其中，顺式-4-羟基-L-脯氨酸在自然界中是一种稀有氨基酸，其能在原骨胶原蛋白合成过程中掺入到多肽链中，导致原骨胶原蛋白的错误折叠，从而在纤维化和肿瘤细胞生长过程中减少胶原沉积。顺式-4-羟基-L-脯氨酸被用来作为一种前体，生产抗纤维化、抗癌以及抗高血压药物。顺式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法有化学合成法和生物转化法。其中，化学合成法的起始原料为反式-4-羟基-L-脯氨酸，本身就是一种昂贵的化学物质，使得化学合成顺式-4-羟基-L-脯氨酸成为一种高成本的过程。生物转化法以其原料来源广泛，产物单一的优点，逐渐成为生产顺式-4-羟基-L-脯氨酸的主要方法。目前，国内尚没有生物转化法生产顺式-4-羟基-L-脯氨酸的报道。
技术实现思路
本专利技术通过将经密码子及mRNA二级结构优化后的脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因连接在含有合适启动子的载体上，在宿主细胞中过量表达该羟化酶，从而将游离的L-脯氨酸转化为顺式-4-羟基-L-脯氨酸。本专利技术所述的利用重组细胞生产顺式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述的重组细胞由如下方法构建：将脯氨酸-顺式-4-羟化酶结构基因(Hypc4)连接到含有高效启动子的载体上，构建含Hypc4基因的表达载体，将所构建的重组载体转化至宿主中，得到过量表达脯氨酸-顺式-4-羟化酶的重组细胞。本专利技术所述重组细胞的构建方法：1.脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因的优化基本方法是根据已公布的脯氨酸-顺式-4-羟化酶的基因序列，通过优化羟化酶基因的密码子，消除一些低使用率的密码子，同时通过同义转换消除所要使用的酶切位点，并优化mRNA的二级结构，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。通过全基因合成，获得优化后的脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因。其中，脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因的来源可以为任何能把游离L-脯氨酸转化为顺式-4-羟基-L-脯氨酸的有机体。2.脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因表达载体的构建基本方法是通过全基因合成的方法合成优化后的脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因，然后根据设计的酶切位点，将合成的基因连接到含有合适启动子的载体上，构建重组载体。启动子可以为任何能够控制基因在宿主菌种表达的控制元件，作为基因表达的载体可以使用任何能在宿主中独立进行复制或者可与宿主染色体发生重组的载体。3.生产顺式-4-羟基-L-脯氨酸的重组细胞的构建基本方法是将所构建的重组载体转化至宿主中，从而获得过量表达脯氨酸-顺式-4-羟化酶的重组细胞。作为宿主可以使用任何能够允许目的基因复制表达的有机体，包括但不局限于大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌、酵母菌等。本专利技术所述重组细胞在生产顺式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用，其特征在于，所述应用是以所述重组细胞在完全培养基中培养，然后将获得的培养物、细胞体或它们的处理物作为酶源，于合适的条件下将游离的脯氨酸转化为顺式-4-羟基-L-脯氨酸。其中，完全培养基中包含重组细胞正常生长及脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因表达所必需的所有物质；用来转化脯氨酸生产顺式-4-羟基-L-脯氨酸的酶源，不仅包括L-脯氨酸-顺式-4-羟化酶的结构基因直接表达的酶，也包括在该酶的基础上做的一些修饰所获得的具有L-脯氨酸-顺式-4-羟化酶活性的蛋白质。顺式-4-羟基-L-脯氨酸的定量测定可以采用高效液相色谱法(HPLC)，也可以使用氯胺T氧化法。附图说明图1.构建的表达载体的图谱。具体实施方式一般性说明：实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒与琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，操作完全按照相应说明进行。全基因合成由上海旭冠公司完成。LB培养基(w/v)：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，pH 7.0-7.2。Amp抗性平板(w/v)：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，氨苄青霉素100μg/ml。GT培养基(w/v)：1％葡萄糖，0.8％胰蛋白胨，0.5％甘油，0.5％硫酸铵，0.1％磷酸氢二钾，0.2％氯化钠，0.02％硫酸镁，0.0015％氯化钙，3mM硫酸亚铁，1％L-脯氨酸。KCM缓冲液:0.5M KCl，0.15M CaCl2，0.25M MgCl2。顺式-4-羟基-L-脯氨酸的测定方法：将发酵液离心后，取上清，稀释后取2.5ml于10ml试管中，加入1ml氯胺T(氯胺T溶液：将1.41g氯胺T溶于10ml水中，依次加入10ml正丙醇和80ml缓冲溶液，其中缓冲溶液配方为：将50g柠檬酸，26.3g NaOH和146.1g结晶乙酸钠溶于水至1L，然后与200ml水以及300ml正丙醇混合。)，摇匀后在室温中放置20min，然后加入1ml显色剂(显色剂：称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35ml高氯酸溶解，缓慢加入65ml异丙醇)，摇匀后迅速将试管移至60℃水浴锅中，保温20min，再用冷水冷却，然后用分光光度计在560nm波长处测定吸光度。实施例1：脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因序列的设计根据大肠杆菌的密码子使用频率来优化基因密码子，消除低使用率的密码子，同时利用同义转换方法消除Hind Ⅲ，BamH I酶切位点，并将原始序列中的终止密码子修改为TAAT强终止子，为了便于将脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因连接到其他载体载体上，因此在起始密码子前加入一个Hind III酶切位点，终止子后面插入一个酶切位点BamH Ⅰ。还要考虑到mRNA的二级结构，保证AUG起始密码子及其后的几个碱基组成的密码子翻译口袋呈打开状态，降低核糖体结合到mRNA上的能势，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。本实施方式中脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因序列的原始序列来源于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)，其原始基因序列见NCBI Gene ID：14808181。本实施方式中优化后的脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因序列提交给上海旭冠公司人工合成，优化后的脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因序列见SEQ ID NO:1。实施例2：脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因表达载体及重组大肠杆菌的构建在含有色氨酸串联启动子(ptrp2)的pES载体上，其启动子3’端依次有Hind Ⅲ和BamH I酶切位点，并且合成的脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因5’端序列带有Hind本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产顺式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的重组细胞的构建方法，其特征在于，先优化并合成L‑脯氨酸‑顺式‑4‑羟化酶的结构基因，然后该结构基因连接到含有合适启动子的表达载体上，构建可过量表达L‑脯氨酸‑顺式‑4‑羟化酶的重组载体，将重组载体转化到宿主中，得到产顺式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的重组细胞。
【技术特征摘要】
1.一株产顺式-4-羟基-L-脯氨酸的重组细胞的构建方法，其特征在于，先优化并合成L-脯氨酸-顺式-4-
羟化酶的结构基因，然后该结构基因连接到含有合适启动子的表达载体上，构建可过量表达L-脯氨酸-顺
式-4-羟化酶的重组载体，将重组载体转化到宿主中，得到产顺式-4-羟基-L-脯氨酸的重组细胞。
2.如权利要求1所述的L-脯氨酸-顺式-4-羟化酶基因的来源可以为任何能把游离L-脯氨酸转化为顺式
-4-羟基-L-脯氨酸的有机体。
3.如权利要求1所述的启动子包括任何能够控制基因表达的调控元件，如lac启动子、T7启动子、色
氨酸启动子、色氨酸串联启动子等。
4.如权利要求1所述的表达载体包...
【专利技术属性】
技术研发人员：张震宇，王付才，张胜利，王晓姣，夏紫薇，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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