一种检测人精子活力的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测人精子活力的方法，它是用流式细胞仪进行检测，步骤如下：(1)取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液；(2)用荧光染料JC-1进行细胞染色；(3)检测：用流式细胞仪检测，其中，激发波长为488nm，获得每一个细胞的FS Lin、SS Log、FL1 Log和FL2 Log的数值；(4)数据分析：以所有细胞的FS Lin为X轴，SS Log为Y轴，绘制散点图，设门后，以门里面的细胞的FL1 Log为X轴，门里面的细胞的FL2 Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1-8％ FL2和FL2-10％ FL1，再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。本发明专利技术可以准确检测精液的活力，方法更为简便、快速。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及一种检测人精子活力的方法。
技术介绍
精子质量或精子活力是评估男性生育能力的重要标准，准确、客观地评价精子的质量是人工授精和体外受精技术成功的关键，用于反映精子质量的指标和评估方法有：精子形态、存活率、活动率、顶体膜完整性、精子线粒体活性等。目前，检测精子活力的金标准是用显微镜直接观察，但是显微镜观察存在费时费力、检测效率低的问题，难以满足临床检测的需要。流式细胞仪能高通量地快速分析细胞状态，可同时对单个细胞进行多荧光参数检测。采用流式细胞术对精子质量进行评估分析，是近几年来刚刚兴起的一项新技术。流式细胞仪可以用来检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位(MMP)，MMP值是反映线粒体能量状态的指标，它与精子活力之间存在正相关，可以反映精子的活力高低。但是目前采用流式细胞仪对精子活力的检测较为粗放，不够准确，主要原因是流式细胞仪检测结果的准确性依赖于检测数据的选择和分析，特别是调整补偿阶段非常关键，但是，目前大多数技术人员不会调整补偿或者难以找到合适的补偿值，导致结果不准确。如，夏欣一等，“JC-1单标法流式细胞术检测精子线粒体膜电位的研究”，中华男科学杂志2008年2月第14卷第2期，公开了一种以JC-1为染料进行流式细胞仪检测精子活力的方法，其流式细胞仪检测未设补偿，检测结果不准确。另外，由于精液粘度大，容易凝固，目前均采用胰蛋白酶或者稀释后反复离心的方式来解决这个问题，但是，这些处理都会降低精子活力，影响检测结果的准确度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种准确、简便、快速的检测人精子活力的方法。本专利技术提供了一种检测人精子活力的方法，它是用流式细胞仪进行检测，步骤如下：(1)取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液；(2)用荧光染料JC-1进行细胞染色；(3)检测：用流式细胞仪检测检测，其中，激发波长为488nm，获得每一个细胞的FS Lin、SS Log、FL1Log和FL2Log的数值；(4)数据分析：以所有细胞的FS Lin为X轴，SS Log为Y轴，绘制散点图，设门后，以门里面的细胞的FL1 Log为X轴，门里面的细胞的FL2 Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1-8％FL2和FL2-10％FL1，再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。其中，步骤(1)中，所述PBS为0.1M，pH7.2的PBS溶液。0.1M是指PBS溶液中磷酸盐的摩尔浓度。其中，步骤(2)中，所述染色是在精液稀释液中，加入荧光染料JC-1至终浓度为2μg/ml，孵育10min。其中，所述孵育的温度为：37℃。其中，步骤(3)中，流式细胞仪检测采用的仪器为美国Beckman公司的FC-500分析型流式细胞仪。其中，步骤(4)中，数据分析采用CXP Analysis软件进行分析。其中，步骤(4)中，设门方式为散射光设门。散射光设门，是指以FSC和SSC联合设门，具体是根据散点图中明显存在的集聚的细胞群和其边缘的散在点群，用矩形设门方式圈出这个明显存在的集聚细胞群，排除其边缘的散在点群。本专利技术通过改进流式细胞仪的数据分析方法，具体是通过设置合适的补偿值，提高了检测方法的准确度；另外，本专利技术人还意外的发现，采用PBS稀释液将精液稀释10倍，即可解决精液粘度大、容易凝固的问题，可以实现准确检测，而且还克服了现有胰蛋白酶或者稀释后反复离心存在的降低精子活力的缺陷。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1流式细胞仪分析的补偿调节图，调整补偿为FL1-8％FL2和FL2-10％FL1。图2对CCCP处理前后的精子的荧光显微镜检测；A、B、C：分别为未经CCCP处理的精子的普通白光、红色荧光(代表高活力精子)和绿色荧光(代表低活力精子)的检测；D、E、F：分别为经CCCP处理的精子的普通白光、红色荧光和绿色荧光的检测；图中标尺代表200μm。图3流式细胞术分析的精子的活力；I、II：未经CCCP处理的人精子的流式细胞术分析；III、IV：CCCP处理后的人精子的流式细胞术分析；门A、门D为两个圈出了主要细胞群的门，门B、门C代表的细胞群来自门A，门E、门F代表的细胞群来自门D；B、E为红色荧光细胞群(代表高活力精子)；C、F为绿色荧光细胞群(代表低活力精子)。图4“正常液化的精液”和“不液化精液”的实物图；A：“正常液化的精液”滴落顺利，不粘稠拖尾；B：“不液化精液”粘稠而且严重拖尾。图5使用本专利技术方法和传统方法处理精液后的精子数量对比图；A：新方法处理的精液；B：传统法处理的精液，图中标尺代表50μm。图6设门以去除杂质碎片；A：FS/SS的原始散点图；B：设门去除杂质碎片，门A为精子主群，门B为杂质碎片群。图7“设立补偿”和“不设立补偿”的散点图对比；A：“设立补偿”的散点图；B：“不设立补偿”的散点图。图8“不设立补偿”、“设立补偿不充分”、“正确设立补偿”和“设立补偿过度”的散点图对比；A：“不设立补偿”的散点图；B：“设立补偿不充分”的散点图，FL1-5％FL2和FL2-5％FL1；C：“设立补偿不充分”的散点图，FL1-7.5％FL2和FL2-7.5％FL1；D：“正确设立补偿”的散点图，FL1-8％FL2和FL2-10％FL1；E：“设立补偿过度”的散点图，FL1-8％FL2和FL2-11％FL1；F：“设立补偿过度”的散点图，FL1-8％FL2和FL2-12％FL1。具体实施方式本专利技术所用的实验仪器与试剂如下：FC-500分析型流式细胞仪(美国Beckman)；DMI3000B型倒置显微镜(德国Leica公司)；UPR-I-10T纯水机(中国优普公司)；3111型CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；SW-CJ-2FD超净工作台(中国苏州净化公司)；TDL-40B型大体积离心机(中国Anke公司)。染料JC-1和解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)来自线粒体膜电位检测试剂盒(中国碧云天)；磷酸缓冲液(PBS)(成都哈里)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人精子活力的方法，其特征在于：它是用流式细胞仪进行检测，步骤如下：(1)取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液；(2)用荧光染料JC‑1进行细胞染色；(3)检测：用流式细胞仪检测，其中，激发波长为488nm，获得每一个细胞的FS Lin、SS Log、FL1Log和FL2Log的数值；(4)数据分析：以所有细胞的FS Lin为X轴，SS Log为Y轴，绘制散点图，设门后，以门里面的细胞的FL1Log为X轴，门里面的细胞的FL2Log为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1‑8％FL2和FL2‑10％FL1，再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。

【技术特征摘要】
1.一种检测人精子活力的方法，其特征在于：它是用流式细胞仪进行检
测，步骤如下：
(1)取待检精液，使用PBS稀释10倍，得到精液稀释液；
(2)用荧光染料JC-1进行细胞染色；
(3)检测：用流式细胞仪检测，其中，激发波长为488nm，获得每一
个细胞的FS Lin、SS Log、FL1Log和FL2Log的数值；
(4)数据分析：以所有细胞的FS Lin为X轴，SS Log为Y轴，绘制散
点图，设门后，以门里面的细胞的FL1Log为X轴，门里面的细胞的FL2Log
为Y轴，绘制散点图，然后调整补偿，补偿为：FL1-8％FL2和FL2-10％FL1，
再设门，最后对门内细胞进行计数，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：万谦，陈强，陆华，高小平，
申请(专利权)人：四川新生命干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51