优化的Fc变体制造技术

本发明专利技术涉及包含Fc区的亲本多肽的变体，该变体与该亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合，且在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。

【技术实现步骤摘要】
本申请是专利技术人于2010年3月19日提交的题为“具优化的Fc变体”的中国专利申请201080017521.8号的分案申请。
本专利技术涉及包含Fc区的亲本多肽的变体。该变体与亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合，且在它的Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。相关技术描述单克隆抗体被用作治疗剂来治疗包括癌症、自身免疫病、慢性炎性疾病、移植排斥、传染病和心血管疾病的多种病症。目前，市场上存在超过二十种批准的单克隆抗体或单克隆抗体片段产品，且超过四百种处于临床开发中。尽管这种接受和前景，但仍存在优化抗体的结构特性和功能特性的显著需要。单克隆抗体在治疗中的用途中的关键问题之一是它们在血液循环中的持久性。抗体清除的速度直接影响治疗的功效，并因此影响可以在患者中引起副作用且还增加治疗费用的药物施用的频率和量。IgG是人类中最主要的免疫球蛋白种类，也最常用于治疗中。已通过与啮齿类动物中被动免疫从母亲至胎儿或新生儿的转移相关的研究阐明了IgG稳态的机制(Brambell,1966,Lancet；2(7473):1087-93；Rodewald,1976,J Cell Biol.；71(2):666-9；Jones等,1972,J Clin Invest.,51(11):2916-27)。在早期研究中，Brambell推测存在用于IgG母胎(maternofetal)传递的受体，且涉及IgG母胎转移和IgG分解代谢的机制可以相同，或者至少非常密切相关(Brambell,1966,Lancet；2(7473):1087-93)。研究发现，极性细胞内和跨极性细胞的IgG转运由Fc区与称为新生儿Fc受体(FcRn)的高亲和力Fc受体的结合介导。FcRn是异二聚体，其包含与I类主要组织相容性复合体分子α-链的胞外域具有结构同源性的跨膜α-链，及由β2-微球蛋白(β2m)组成的可溶性轻链(Simister和Mostov,1989,Cold Spring Harb Symp Quant Biol.:54Pt 1:571-80)。在人类中，FcRn表达在胎盘细胞中；肠、肾和支气管上皮细胞中；内皮细胞中；及造血细胞(hematopoetic cell)，如小肠巨噬细胞、单核细胞和单核细胞衍生的树枝状细胞中(Zhu X等,2001,J Immunol.；166:3266-76)。FcRn以pH依赖性方式结合它的两种主要配体IgG和血清白蛋白，在pH 6.0-6.5下有效结合，而在pH 7.0-7.5下释放(Raghavan等,1995,Biochemistry.,34:14649-57)。针对IgG免受分解代谢提出的机制是，IgG通过非特异性胞饮作用内化进入内皮细胞的内体，其中低pH促进与FcRn结合(Ghetie和Ward,1997,Nat.Biotechnol.,15:637-40)。结合的IgG-FcRn复合体再循环回到细胞表面，并在细胞外液的中性pH下解离，回到血液中的循环。未与FcRn结合的IgG转运进入溶酶体中，其中它们被蛋白酶降解。根据IgG存活的浓度依赖性分解代谢机制，在低血清IgG浓度下，受体将结合所有胞吞的IgG，并有效地使其回到循环，产生长的IgG半衰期。相反，在高IgG浓度下，受体被IgG饱和，IgG的主要级分未被受体结合，并转运降解，产生未结合的IgG的更快的分解代谢。小鼠IgG的Fc区中的多种位点特异性诱变实验已导致涉及IgG和FcRn间相互作用的某些关键氨基酸残基的鉴定(Kim等,1994,Eur J Immunol.；24:2429-34；Kim等,1994,Eur J Immunol；24:542-8；Medesan等,1996,Eur J Immunol.；26:2533-6；Medesan等,1997,J Immunol.；158:2211-7)。这些研究和序列比较研究发现，位置253上的异亮氨酸、位置310上的组氨酸和位置435上的组氨酸(根据Kabat编号，Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))在人和啮齿类动物IgG中高度保守，暗示它们在IgG-FcRn结合中的重要性。这些残基定位在CH2-CH3结构域界面上，功能位点定位于这些残基符合与大鼠Fc复合的大鼠FcRn的X射线晶体结构(Burmeister等,1994,Nature；372(6504):379-83)。Ghetie等(1997,Nat.Biotechnol；15:637-40)在小鼠IgG1 Fc-铰合部片段中随机诱变了位置252、位置254和位置256。与野生型相比，一个突变体对小鼠FcRn显示高3.5倍的亲和力和在两个小鼠品系中分别长约23％或65％的半衰期。Kim等(1999,Eur J Immunol；29:2819-25)通过Fc区的位置253、位置310或位置435上的氨基酸取代诱变了人IgG1。他们发现，与野生型IgG1 Fc-铰合部片段相比，突变体Fc-铰合部片段在小鼠中具有减少的血清半衰期，并得出Ile253、His310和His435在调节IgG的血清半衰期中发挥中心作用的结论。Hornick等(2000,J Nucl Med.,41:355-62)显示，嵌合人IgG1抗体Fc区中位置253上的单个氨基酸取代在小鼠中加快清除，并改善实体瘤的免疫闪烁显像(immunoscintigraphy)。Shields等(2001,J Biol Chem；276:6591-604)用丙氨酸扫描诱变改变人IgG1抗体的Fc区中的残基，然后评估与人FcRn的结合。在改变为丙氨酸时有效废除与FcRn的结合的位置包含I253、S254、H435和Y436。在结合中显示较不显著的减少的其他位置如下：E233-G236、R255、K288、L309、S415和H433。几个氨基酸位置在改变为丙氨酸时显示FcRn结合的改善，这些位置尤其是P238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424和N434。许多其他氨基酸位置显示FcRn结合的轻微改善(D265、N286、V303、K360、Q362和A378)或无变化(S239、K246、K248、D249、M2本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含Fc区的亲本多肽的变体，该变体与所述亲本多肽相比显示增加的与FcRn的结合，且包含至少两个氨基酸修饰，所述至少两个氨基酸修饰包含：(i)选自Fc区的378V、378T、434Y和434S的一个氨基酸修饰；和(ii)选自Fc区的226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、389K、434Y和434S的至少氨基酸修饰；其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。

【技术特征摘要】
2009.03.20 EP 09305250.41.包含Fc区的亲本多肽的变体，该变体与所述亲本多肽相比显示增
加的与FcRn的结合，且包含至少两个氨基酸修饰，所述至少两个氨基酸
修饰包含：
(i)选自Fc区的378V、378T、434Y和434S的一个氨基酸修饰；和
(ii)选自Fc区的226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、
264E、307P、315D、330V、362R、378V、378T、389T、389K、434Y和
434S的至少氨基酸修饰；
其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号，只要修饰
(i)不发生在与修饰(ii)相同的氨基酸位置上。
2.权利要求1的变体，所述变体与所述亲本多肽相比包含选自Fc区
的
226G/315D/434Y，230S/315D/434Y，230T/315D/434Y，230T/264E/434S，230T/389T/434S，
241L/264E/378V，241L/264E/434S，250A/389K/434Y，259I/315D/434Y，264E/378T/396L，
264E/378V/416K，264E/378V/434S，264E/396L/434S，294deI/307P/434Y，
307P/378V/434Y，315D/330V/434Y，315D/382V/434Y和378V/383N/434Y的至
少一个氨基酸修饰组合，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中EU索引
的编号。
3.权利要求2的变体，其中所述变体与所述亲本多肽相比进一步包含
选自Fc区的226G、227L、230S、
230T，230L，231T，241L，243L，250A，256N，259I，264E，265G，267R，290E，294deI，303A，
305A，307P，307A，308I，315D，322R，325S，327V，330V，342R，347R，352S，361D，362R，
362E，370R，378V，378T，382V，383N，386R，386K，387T，389T，389K，392R，395A，396L，
397M、403T、404L、415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、
434S和439R的至少一个氨基酸修饰，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat
中EU索引的编号。
4.权利要求1或2的变体，其中所述变体与所述亲本多肽相比包含选
自Fc区的
307A/315D/330V/382V/389T/434Y，256N/378V/383N/434Y，315D/330V/361D/378V/434Y，
259I/315D/434Y，230S...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·贝伦斯，S·若里约克斯，A·卡拉特，K·布阿亚迪，P·蒙东，C·莫内马尔斯，
申请(专利权)人：法国血液分割暨生化制品实验室，
类型：发明
国别省市：法国;FR