温度敏感型载体pBBR1MCS‑2‑Ts1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了温度敏感型载体pBBR1MCS‑2‑Ts1及其应用。本发明专利技术所提供的温度敏感型载体，是将SEQ ID No.1的第1557‑2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组载体；目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A1)的改造得到的蛋白质：A1)为如下A11)、A12)和A13)：A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中温度敏感型载体pBBR1MCS-2-Ts1及其应用。
技术介绍
把一段有用的目的DNA片段通过DNA重组技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具叫载体(Vector)。质粒是重组DNA技术中常用的载体，质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。一个理想的载体大致应有下列一些特性：(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型；(2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点；(3)能插入较大的外源DNA片段；(4)具有遗传标记，便于鉴定和筛选；(5)对宿主细胞无害。宽宿主质粒pBBR1MCS-2是应用性很广的载体，该质粒由pBBR1质粒改造而来。pBBR1质粒来源于革兰氏阴性菌Bordetella bronchiseptica S87(Antoine R and Locht C.Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from Gram-positive organisms.Mol Microbiol.1992,6(13):1785-1799)。pBBR1MCS-2含有一个卡那霉素(kan)抗性筛选标记，它的大小仅有5145bp，这些特r>性使得该质粒适用于DNA克隆、蛋白表达，广泛用于革兰氏阴性菌的分子操作。温度敏感型质粒载体可以方便的控制质粒在宿主中的存在。当温度比较低时，质粒可以存在宿主中，而当温度提高后，温度敏感型质粒载体将丢失或整合到染色体上。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何构建温度敏感型载体。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了构建重组载体的方法。本专利技术所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法1，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体，将该重组载体命名为pBBR1MCS-2-Ts1；所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A1)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质，即所述目的基因表达盒编码的蛋白质为SEQ ID No.4所示的蛋白质：所述A1)为如下A11)和/或A12)和/或A13)：A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。上述方法1中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行B1)的改造、保持SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子，即所述目的基因表达盒的序列为SEQ ID No.3：所述B1)为如下B11)和/或B12)和/或B13)和/或B14)：B11)将SEQ ID No.1第1827位的G突变为A；B12)将SEQ ID No.1第2034位的G突变为C；B13)将SEQ ID No.1第2212位的A突变为T；B14)将SEQ ID No.1第2249位的C突变为A。其中，SEQ ID No.1由5145个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸为rep的编码基因，编码SEQ ID No.2所示的rep蛋白。SEQ ID No.3的第238-900位编码SEQ ID No.4所示的蛋白质。上述方法1中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为SEQ ID No.1的第1557-1793位所示的DNA分子；所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQ ID No.1的第2457-2526位所示的DNA分子。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了构建重组载体的方法。本专利技术所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法2，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体；所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行所述A1)及下述A2)、A3)和A4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：A2)将SEQ ID No.2第130位的His突变为Gln；A3)将SEQ ID No.2第86位的Arg突变为Cys；A4)如下A41)和/或A42)：A41)将SEQ ID No.2第25位的Lys突变为Glu；A42)将SEQ ID No.2第146位的Ile突变为Val。上述方法2中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行所述B1)及下述B2)、B3)和B4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：B2)将SEQ ID No.1第2183位的C突变为G；B3)将SEQ ID No.1第2049位的C突变为T；B4)如下B41)和/或B42)：B41)将SEQ ID No.1第1866位的A突变为G；B42)将SEQ ID No.1第2229位的A突变为G。上述方法2中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为将SEQ ID No.1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、C3)和C4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：C2)如下C21)和/或C22)：C21)将SEQ ID No.1第1732位的A突变为G；C22)将SEQ ID No.1第1780位的G突变为T；C3)如下C31)和/或C32)：C31)将SEQ ID No.1第1747位的C突变为T；C32)将SEQ ID No.1第1776位的T突变为A；C4)将SEQ ID No.1第1751位的T本文档来自技高网...

【技术保护点】
构建重组载体的方法，是将SEQ ID No.1的第1557‑2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体；所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A1)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：所述A1)为如下A11)和/或A12)和/或A13)：A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。

【技术特征摘要】
1.构建重组载体的方法，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段
替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即
为所述重组载体；
所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A1)的改
造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：所述A1)为如下A11)
和/或A12)和/或A13)：
A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；
A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；
A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中的目的基
因为将SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行B1)的改造、保持
SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的
DNA分子：所述B1)为如下B11)和/或B12)和/或B13)和/或B14)：
B11)将SEQ ID No.1第1827位的G突变为A；
B12)将SEQ ID No.1第2034位的G突变为C；
B13)将SEQ ID No.1第2212位的A突变为T；
B14)将SEQ ID No.1第2249位的C突变为A。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中启动所
述目的基因表达的启动子为SEQ ID No.1的第1557-1793位所示的DNA分子；所述目
的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQ ID No.1的第2457-2526位所
示的DNA分子。
4.构建重组载体的方法，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段
替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即
为所述重组载体；
所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行权利要求
1所述A1)及下述A2)、A3)和A4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.2的
其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：
A2)将SEQ ID No.2第130位的His突变为Gln；
A3)将SEQ ID No.2第86位的Ar...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄建忠，江贤章，周芬，刘洪娇，祁峰，张明亮，陶勇，
申请(专利权)人：福建师范大学，中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35