一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术方法是以榨糖工业的主要副产物甘蔗渣为原料，经过粉碎，稀碱预处理，以及纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶的共同水解，得到水解糖液；利用琥珀酸放线杆菌发酵水解糖液生产丁二酸，同时在发酵液中添加甘蔗渣水解的残渣，使得发酵可以反复运行，节省种子培养，而且可以用有机溶剂萃取稀碱预处理后的残液中的糠醛。本发明专利技术方法，实现了甘蔗渣水解残渣的合理使用，减少常规发酵的种子培养环节，节约了发酵成本、提高了发酵效率，同时对发酵设备要求低，不需要对已有的发酵罐做出额外改进，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程

技术介绍
甘蔗渣是一种重要的木质纤维类可再生原料，我国是世界上甘蔗种植量第三大的国家，南方是中国主要种植甘蔗的地区，每年甘蔗总产量达到7000多万吨，同时会产生700万吨的甘蔗渣。甘蔗渣中主要组分为纤维素、半纤维素和木质素。目前甘蔗渣的主要用途是燃烧发电(轻工科技,2013,(11):11-12.)、作为家畜饲料(中国专利申请号94113455.5)、替代传统的木材资源作为造纸和生产高密度材料(中国塑料,2008,(02):57-61)、作为食用菌的培养基(食用菌,1980,(02):12-16)、以及开发生产高附加值产品：如开发生产木糖醇(科技通报,2004,(1):37-41)、阿拉伯糖(氨基酸和生物资源,2009,(1):8-12.)、糠醛(化工科技市场,2001,(11):12-15)。中国专利CN 1060464C公布了用蔗渣碱木质素催化氧化制备丁香醛和香兰素的方法。中国专利CN 103614435A公布了一种从甘蔗渣制备低聚木糖的方法。丁二酸是工业上一种重要的C4平台化合物，在食品、医药、化学工业以及其他领域都有着广泛的应用。目前文献报道的发酵生产丁二酸研究所用的培养基碳源主要是葡萄糖，开发价格低廉的碳源是降低发酵法生产丁二酸成本的途径之一。巴西Borge等报道用稀硫酸酸解甘蔗渣，得到的糖液作为碳源，用A.succinogenes CIP 106512厌氧摇瓶发酵丁二酸24h，得到丁二酸的浓度最高为22.5g.L-1(Industrial Microbiology and Biotechnology,2011,38:1001-1011.)。徐蓉等用稀硫酸酸解甘蔗渣，再用纤维素酶水解预处理的残渣，甘蔗渣水解液发酵丁二酸，得到20g.L-1的丁二酸(化工进展,2013,04:874-877.)。但用这些方法发酵生产的丁二酸，产量较低，增加了后续提取的成本。本专利技术提供了一种甘蔗渣高效水解和生产高浓度丁二酸的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用廉价甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法。所述发酵生产丁二酸的方法，是将甘蔗渣粉碎、稀碱预处理、水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添加4～20g.L-1的甘蔗渣水解后的残渣(干重)作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补料分批发酵生产丁二酸。所述甘蔗渣粉碎、稀碱预处理，在本专利技术的一种实施方式中，是以榨糖工业废弃物甘蔗渣为原料，将干的甘蔗渣粉碎，过20-40目筛，40-70℃烘干保存，用质量浓度为0.5-5％的NaOH溶液，按固液比1:1-1:15(w/v)，121℃高温预处理甘蔗渣2-4h，过滤水洗得甘蔗渣，45-70℃烘干备用。所述甘蔗渣粉碎、稀碱预处理，在本专利技术的一种实施方式中，稀碱预处理甘蔗渣后的残液，用体积比为1:0.5～1:1的氯仿萃取，得到糠醛粗品。所述水解，在本专利技术的一种实施方式中，是将预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3～10％的溶液，在纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶的协同作用下水解，水解温度40-70℃，pH调至4.0-6.5，转速100-250r.min-1，时间24-72h。水解后，经离心得水解糖液，固体烘干即得甘蔗渣水解后的残渣。所述水解，在本专利技术的一种实施方式中，纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶对每克底物的的添加量分别为：10-35FPU.g-1、50-120U.g-1、10-80U.g-1和5-30U.g-1。所述甘蔗渣水解后的残渣，在本专利技术的一种实施方式中，添加量为8～18g.L-1。所述反复分批发酵或反复补料分批发酵，在本专利技术的一种实施方式中，是指采用分批发酵或补料分批发酵的方式生产丁二酸，每一批次结束后，静止，待发酵液中甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。所述方法，在本专利技术的一种实施方式中，是：(1)以甘蔗渣水解糖液为碳源，制备发酵培养基，其中培养基中甘蔗渣水解液糖浓度20～100g.L-1；(2)在发酵培养基中添加4～20g.L-1的甘蔗渣水解后的残渣，然后按5～10％的接种量接种，在温度35～40℃、pH 5.8～6.5的厌氧条件下分批发酵或补料分批发酵20～60h；(3)发酵结束后静止，待发酵液中甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。所述步骤(1)的发酵培养基，在本专利技术的一种实施方式中，包括：甘蔗渣水解液糖浓度20～100g.L-1，玉米浆浓度10～30g.L-1，无水氯化钙浓度0.05～0.5g.L-1，磷酸氢二钾浓度1～5g.L-1，磷酸二氢钠浓度4～12g.L-1，六水氯化镁浓度0.05～0.5g.L-1，硫化钠浓度0.05～0.5g.L-1。所述步骤(1)的发酵培养基，在本专利技术的一种实施方式中，甘蔗渣水解液糖浓度55g.L-1。所述步骤(2)的发酵，在本专利技术的一种实施方式中，通入CO2/N2气体控制发酵过程为厌氧条件，饱和NaHCO3控制发酵pH 5.8～6.5。所述步骤(2)的补料分批发酵，在本专利技术的一种实施方式中，是发酵培养基初始糖浓度为50g/L以上的补料发酵，当发酵液中还原糖浓度低于20g.L-1时，开始补加甘蔗渣水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10-20g.L-1，发酵25-50h。所述步骤(2)的分批，在本专利技术的一种实施方式中，是发酵3-5个批次。所述琥珀酸放线杆菌，在本专利技术的一种实施方式中，是A.ssuccinogenes F3-21或琥珀酸放线杆菌CGMCC NO.1593、CCTCC NO：M 2012036。所述步骤(3)中的发酵结束，在本专利技术的一种实施方式中，是指发酵液还原糖浓度小于10g.L-1或小于5g/L。所述方法，在本专利技术的一种实施方式中，具体是：(1)甘蔗渣预处理：甘蔗渣粉碎20-60目筛，40-70℃烘干，用质量浓度为0.5-5％的NaOH溶液，按照固液比1:1～1:20(w/v)，121℃高温预处理甘蔗渣1～4h，过滤水洗得到预处理的甘蔗渣，45-70℃烘干备用；(2)甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3～10％的溶液，添加纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶，在温度40～70℃，pH调至4.0～6.5，转速100-250r.min-1的条件下，水解24～72h；其中纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，所述方法是将甘蔗渣粉碎、稀碱预处理、水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添加4～20g·L‑1的甘蔗渣水解后的残渣作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补料分批发酵生产丁二酸。

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，所述方法是将甘蔗渣粉碎、稀碱预处理、
水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添加4～20g·L-1的甘蔗渣水解后的残渣作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补料分批发酵生产丁
二酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反复分批发酵或反复补料分批发酵，
是指采用分批发酵或补料分批发酵的方式生产丁二酸，每一批次结束后，静止，待发酵液中
甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜培养基，
不需要接种，直接进行下一批次发酵。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)以甘蔗渣水解糖液
为碳源，制备发酵培养基，培养基中甘蔗渣水解液糖浓度20～100g·L-1；(2)在发酵培养基中
添加4～20g·L-1的甘蔗渣水解后的残渣，然后按5～10％的接种量接种，在温度35～40℃、pH
5.8～6.5的厌氧条件下分批发酵或补料分批发酵20～60h；(3)发酵结束后静止，待发酵液中
甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养
基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的补料分批发酵是发酵培
养基初始糖浓度为50g/L以上的补料发酵，当发酵液中还原糖浓度低于20g·L-1时，开始补加
甘蔗渣水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10-20g·L-1，发酵25-50h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基是：甘蔗渣水解液糖浓度
20～100g·L-1，玉米浆浓度10～30g·L-1，无水氯化钙浓度0.05～0.5g·L-1，磷酸氢二钾浓度1～5
g·L-1，磷酸二氢钠浓度4～12g·L-1，六水氯化镁浓度0.05～0.5g·L-1，硫化钠浓度0.05～0.5g·L-1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水解糖液和甘蔗渣水解后的残渣的制
备方法是：甘蔗渣粉碎20-60目筛，40-70℃烘干，用质量浓度为0.5-5％的NaOH溶液，按照
固液比1:1～1:20(w/v)，高温预处理甘蔗渣1～4h，过滤水洗得到预处理的甘蔗渣，45-70℃
烘干备用；然后将预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3～10％的溶液，添加纤维素酶、木聚糖酶、
β-葡聚糖酶和果胶酶，在温度40～70℃，pH调至4.0～6.5，转速100-250r·min-1的条件下，水

【专利技术属性】
技术研发人员：郑璞，淘声涛，查鑫华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32