本发明专利技术公开了一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒。本发明专利技术根据GenBank中的弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计了1对引物，通过对荧光定量PCR反应条件进行优化，研制出弗氏柠檬酸杆菌的荧光定量PCR诊断试剂盒，以期对临床样品进行简便、快捷、灵敏、准确的检测，为该病的防制提供科学依据。根据以上研究设计的引物，将其应用在荧光定量PCR快速检测试剂盒中，可快速检测出弗氏柠檬酸杆菌，并且具有良好的特异性及敏感性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种试剂盒，尤其是一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒。
技术介绍
弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)是革兰氏阴性短杆菌，在土壤、水体、污水、食物中广泛存在，为人和动物肠道的正常菌群，该菌是一种条件致病菌，可引起人、畜、鱼类的败血症[1-3]。近几年，贵州省冷水鱼的养殖发展迅速，主要品种有虹鳟、金鳟、斑点鳟鲑、鲟鱼、以及大鲵。随着冷水鱼养殖场（户）集约化程度不断提高，苗种流通交换量不断加大，病害逐渐增多，病情不断愈趋复杂。目前报道的病害报道主要集中在鲟鱼、虾、中华鳖，鳟鲑鱼、大鲵报道较少，感染该菌的鲟鱼、虾、中华鳖、鳟鲑鱼和大鲵出现消化不良或拒食，头部、腹部肿大，轻度腹水，皮下有出血点等症状，随后死亡[4-7]。
技术实现思路
本专利技术的目的是：传统的细菌分离鉴定耗时较长，不能快速、准确地得到鉴定结果，从而对症下药。应用荧光定量PCR技术进行疾病病原菌的鉴定和诊断，较普通PCR反应程序快、特异性强、灵敏度高、重复性好、结果简单可视。提供一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它可以快速检测弗氏柠檬酸杆菌，并且简便、灵敏、准确、特异性强。本专利技术是这样实现的：弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它包括250μL荧光定量PCR反应混合液；上游引物20μL、浓度为10nmol/μL、下游引物20μL、浓度为10nmol/μL；荧光核酸染料25μL、浓度为25mmol/μL；40μL阳性对照；40μL阴性对照；170μL超纯水；上游引物的序列为：5'-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3'，下游引物的序列为： 5'-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3'。阴性对照为超纯水。阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因pMD-18T阳性质粒样品。荧光定量PCR反应混合液由5 mmol/μL的氯化镁，1000pmol/μL的 dNTP 4.0μL，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μL Taq酶组成。试剂盒的保存期检测试剂盒保存期：将试剂盒各组份于室温、4 ℃、-20 ℃，保存时间1周、3月、6月、1年，对标准阳性样品进行检测。4℃保存1年阳性拷贝数降低100倍，-20℃保存1月、3月、6月、1年对阳性拷贝数无影响。本专利技术根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计1对特异性的引物，通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因片段，T克隆到pMD-18T载体上作为标准阳性样品。通过优化SYBR Green I荧光定量PCR反应条件，建立了弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，再以建立的诊断方法研制出试剂盒。试剂盒对致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌均无阳性信号扩增，重复性好，扩增产物的熔解曲线只出现1个特异性峰值，无引物二聚体，灵敏度可达1.0×10１拷贝/μL，结果表明，研制的弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒适合于弗氏柠檬酸杆菌临床疑似病料样品的快速诊断。为了验证本专利技术的技术效果，进行了以下实验：弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断方法的建立1 材料与方法1.1 试验材料菌株：弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌，由贵州重大疫病监测防制重点实验室保存。主要试剂：MIX PCR酶、pMD-18T、SYBR Green I荧光定量PCR酶、Goldview、1×TAE电泳缓冲液、DL2000、DH5α，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，细菌基因组DNA提取试剂盒、PBS缓冲液等购自上海捷瑞生物工程公司，引物为上海捷瑞生物工程公司合成，其他为国产试剂。主要仪器：EppendorfMastercycler ep realplex 4 实时荧光定量PCR仪。试验方法1.2.1 引物设计 根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA序列，设计1对引物，上游引物：5'-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3'，下游引物: 5'-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3'，预计扩增产物大小为117bp。核酸的提取 （1）组织样品：取患病大鲵肝脏组织约1.0 g，加入0.1mol/L PBS缓冲液2 mL进行研磨，然后置-70℃低温冰箱反复冻融3次，5000 r/min离心，取上清液970μL加入10%SDS 20μL，蛋白酶K 10μL（20mg/mL），55℃反应30 min，5000 r/min离心，取上清液用细菌基因组DNA试剂盒提取基因组，提取的基因组置-20℃保存。 （2）细菌样品：细菌样品DNA提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，提取的基因组置-20℃保存。fre阳性标准品的制备 通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因片段，PCR反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火温度55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；最后72℃延伸10min。将扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段，与pMD-18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，重组体命名为pMD-18T- fre，同时送上海捷瑞生物工程公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T- fre在D260nm/D280nm处的吸光度，得到重组质粒的浓度和纯度，进行10倍梯度倍比稀释，作为阳性标准品。荧光定量PCR反应条件的优化荧光定量PCR反应体系25 μL，对退火温度（50℃、55℃、60℃），引物浓度（5、10、20 μmol/L），荧光定量的反应时间、体系，进行优化以确定最佳反应条件。反应体系为：上下游引物（5、10、20 μmol/L）各1μL，Premix Ex Taq 12.5μL，ROX Reference Dye 0.5μL，模板1 μL，用超纯水补足至25 μL，同时以超纯水作为空白对照。反应条件为：94℃ 10s；94℃ 5s、退火温度（50℃、55℃、60℃）10s、72℃10s，40个循环。荧光定量PCR反应标准曲线的构建 用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-fre，计算出重组质粒的浓度和纯度，以及DNA拷贝数；将标准阳性样本连续10倍倍比稀释，以1.2.4的优化好的条件进行扩增，每个稀释倍数3个重复，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。敏感性试验 计算出重组质粒pMD-18T-fre DNA拷贝数，10倍倍比稀释后分别进行荧光定量PCR反应，每个稀释倍数3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断的敏感性。特异性试验 分别以弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌DNA进行荧光定量PCR反应，每个样品3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性。重复性试验 应用建本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于：它包括250μL荧光定量PCR反应混合液；上游引物20μL、浓度为10nmol/μL、下游引物20μL、浓度为10nmol/μL；荧光核酸染料25μL、浓度为25mmol/μL；40μL阳性对照；40μL阴性对照；170μL超纯水；上游引物的序列为：5'‑CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG‑3'，下游引物的序列为： 5'‑TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC‑3'。
【技术特征摘要】
1.一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于：它包括250μL荧光定量PCR反应混合液；上游引物20μL、浓度为10nmol/μL、下游引物20μL、浓度为10nmol/μL；荧光核酸染料25μL、浓度为25mmol/μL；40μL阳性对照；40μL阴性对照；170μL超纯水；上游引物的序列为：5'-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3'，下游引物的序列为： 5'-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3'。
2.根据权利要求1所述的弗氏柠...
【专利技术属性】
技术研发人员：余波，徐景峨，罗永成，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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