本发明专利技术属于生物传感器技术领域，具体公开了一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法。所述方法包括如下步骤：S1.免疫生物传感器的制备，检测该传感器的工作曲线，待用；S2.组胺单克隆抗体的制备；S3.酶标抗体的制备；S4.传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量测定组胺浓度。该方法具有检测限低、灵敏度高、线性范围广、适用于现场检测等优点，可用于样品中组胺检测，适用于在非实验室设置中测定海产食品和鱼组织中的组胺值，实现监管部门的现场快速监测，为海产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感器
，更具体地，涉及一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法。
技术介绍
我国鱼类资源丰富，也是水产品生产和消费大国，水产品及其加工在国民经济和消费中都占有重要地位。组胺(Histamine)是游离组氨酸在组氨酸脱羧酶的催化下发生脱羧反应形成的，是一种具有毒性的生物胺，广泛存在于各种生物体及食品中，主要为水产品，尤其是青皮红肉特征的中上层海水鱼及其加工产品。研究表明，若过量摄入组胺会引起头痛恶心、反胃呕吐、腹泻、心悸、瘙痒性皮疹、血压变化等一系列的过敏反应。摄入8~40 mg组胺会产生轻微的中毒症状，超过40 mg产生中等中毒症状，超过100 mg产生严重中毒症状。美国FDA通过对爆发组胺中毒的大量数据的研究，确定组胺的危害作用水平为500 mg/kg（食品）。近年来，我国在广东、浙江、山东等多地都爆发过组胺中毒事件，据报道，仅杭州下城区，在1997年至2006年的十年间就发生7次组胺中毒事件。因此，组胺含量对于保障消费者健康具有十分重要的意义，目前国内外把组胺列为水产品的必检项目。组胺作为小分子，仅有一个抗原活性位点，很难实现直接检测，目前食品中组胺测定的方法主要有偶氮试剂比色法、高效液相色谱法、荧光分析法、气相色谱法等等。这些方法都存在一定的缺陷，如仪器及耗材较为昂贵，成本高，步骤较繁琐，耗时长，试剂有毒，有的则需要技术熟练的操作人员，都不适合现场快速检测。电化学免疫传感器是将高特异性的抗原抗体结合反应与高灵敏的传感技术相结合，是21世纪最有前途的检测手段之一。但是，组胺分子量极小（111 Da），而且只有一个抗原活性位点，很难实现直接电化学免疫检测。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法。所述方法通过建立一种直接竞争免疫传感器法实现对组胺的定量检测，从而可通过检测海产食品和鱼组织中的组胺值来判断海产食品和鱼制品的新鲜度和腐败程度。该方法适用于在非实验室设置中测定海产食品和鱼组织中的组胺值，实现监管部门的现场快速监测。本专利技术是通过以下技术方案实现上述目的的。一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法，包括如下步骤：S1. 免疫生物传感器的制备：普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极，然后，将组胺包被原固定在电极表面，滴涂封闭液制得所述免疫生物传感器，检测该传感器的工作曲线，待用；S2. 组胺单克隆抗体的制备；S3. 酶标抗体的制备：用辣根过氧化酶标记S2制得的组胺抗体；S4. 传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量测定组胺浓度；其中，所述组胺包被原的包被浓度为0.001 ~1 mg/mL；S4所述酶标抗体的原液浓度为 5 mg/mL，稀释10 ~1000倍使用。本专利技术采用普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极，普鲁士蓝(Fe4[Fe(CN)6]3)是非常好的导电媒介体，可以加速电子的传递；壳聚糖具有较好的粘度和较小的空间位阻，使其具有良好的生物相容性和成膜性；纳米金在电化学反应中也具有突出的优良特性。本专利技术将普鲁士蓝、壳聚糖、纳米金组成复合膜，其电流响应比单独沉积普鲁士蓝或纳米金具有明显地稳定性。复合膜中壳聚糖作为导电分子因其自身表面带正电及生物相容性好而被广泛应用在传感器中生物分子的固定，普鲁士蓝膜具有非常好的电催化活性，而纳米金颗粒与组胺包被原结合加速生物界面与蛋白活性位点间的电子传递。将电极浸入沉积液中，施加电压后，铁离子会发生自身的氧化还原反应，而纳米金和壳聚糖分子则依附离子运动一起沉积到电极表面形成普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜。这三者的复合是相互协调，缺一不可的。若沉积液中非氧化还原成分增多则会影响以普鲁士蓝为核心的复合膜沉积效果，且三种材料的制备都相对容易，适于大批量制备并在市场中推广应用。组胺包被原是组胺与蛋白的偶联复合物，在一定浓度范围内，调整包被原的浓度可以得到不同线性范围的工作曲线，但是包被原浓度过高的话会阻碍电子传递而使免疫传感器的灵敏度下降。将组胺包被原固定在电极表面，检测时，仅需添加等体积的酶标抗体和待测样液，固定在电极表面的组胺包被原和样液中衍生的组胺会竞争结合酶标组胺抗体，和电极上包被原结合的组胺抗体就可以“存在”电极表面；而与游离组胺结合的抗体就被缓冲溶液冲洗“离开”电极表面。然后添加测试液和过氧化氢，对免疫传感器进行循环伏安法扫描测试，辣根过氧化酶可以在一定的电位下催化过氧化氢进行自身的氧化还原反应，同时通过双电子传递过程测试液也被氧化，还原峰变大，通过前后峰电流值变化的大小来定量测定组胺浓度。检测过程中发生的反应如下：HRP(Fe3+) + H2O2 ? Compound(I) + H2O （1）Compound(I) + QH ? Compound(II) + Q （2）Compound(II) + QH ? HRP(Fe3+) + Q +H2O （3）Q + H +2 e- ? QH (电化学反应) （4）其中，QH代表测试液，Q代表测试液的氧化态。优选地，S3所述酶标抗体中辣根过氧化酶和组胺抗体的质量比为3:1。优选地，所述S3包括如下步骤：将辣根过氧化酶溶解于缓冲液中，加入0.1mol/L NaIO4溶液，溶液呈黄绿色，再加入2.5%乙二醇溶液；再加入S3制得的组胺抗体，混匀；将上述混合溶液加入透析袋中，在缓冲液中透析过夜；透析后加入5mg/mL NaBH4溶液，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，离心，将沉淀溶于缓冲液中，再次透析过夜，离心，取上清液作为酶标抗体。更优选地，所述S3包括如下步骤：将6 mg辣根过氧化酶HRP溶解于pH为5.4~5.8的缓冲液中，加入0.05~0.2 mL 0.1 mol/L NaIO4溶液，4~6℃避光反应20~40 min，溶液呈黄绿色；再加入0.05~0.2 mL 2.5%乙二醇溶液，室温下反应20~40 min；再加入2 mg S1制备的组胺抗体，混匀；将上述混合溶液加入透析袋中，在浓度为0.05 mol/L、pH为9.4~9.8的缓冲液中透析过夜；透析后加入0.02~0.06 mL 5mg/mL的NaBH4溶液，混匀，4~6 ℃静置1~3 h，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，4~6℃反应20~40 min后3000~5000 r/min离心10~20 min，将沉淀溶于少量磷酸缓冲液中，再次透析过夜，离心，取上清液，混匀作为酶标抗体。优选地，S4所述测试液含有1 ~ 5 mmol/L对苯二酚和1/100 ~ 1/15 mol/L 磷酸缓冲液。优选地，S4所述过氧化氢的浓度为0.96~7.2 mmol/L。优选地，S4所述过氧化氢添加量为20~60μL。优选地，S4所述测试液为4~10 mL。优选地，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1. 免疫生物传感器的制备：普鲁士蓝‑壳聚糖‑纳米金复合膜修饰电极，然后，将组胺包被原固定在电极表面，滴涂封闭液制得所述免疫生物传感器，检测该传感器的工作曲线，待用；S2. 组胺单克隆抗体的制备；S3. 酶标抗体的制备：用辣根过氧化酶标记S2制得的组胺抗体；S4. 传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量测定组胺浓度；其中，所述组胺包被原的包被浓度为0.001~1 mg/mL；S4所述酶标抗体的原液浓度为5 mg/mL，稀释10 ~1000倍使用。
【技术特征摘要】
1.一种利用免疫生物传感器检测组胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 免疫生物传感器的制备：普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金复合膜修饰电极，然后，将组胺包被原固定在电极表面，滴涂封闭液制得所述免疫生物传感器，检测该传感器的工作曲线，待用；
S2. 组胺单克隆抗体的制备；
S3. 酶标抗体的制备：用辣根过氧化酶标记S2制得的组胺抗体；
S4. 传感器检测组胺：将等体积的待测样液和S3制得的酶标抗体混匀后，滴涂在电极工作区域，将所述电极浸在测试液中，并添加过氧化氢，通过前后峰电流值的变化大小定量测定组胺浓度；
其中，所述组胺包被原的包被浓度为0.001~1 mg/mL；
S4所述酶标抗体的原液浓度为5 mg/mL，稀释10 ~1000倍使用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3所述酶标抗体中辣根过氧化酶和组胺抗体的质量比为3:1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S3包括如下步骤：将辣根过氧化酶溶解于缓冲液中，加入0.1mol/L NaIO4溶液，溶液呈黄绿色，再加入2.5% 乙二醇溶液；再加入S3制得的组胺抗体，混匀；将上述混合溶液加入透析袋中，在缓冲液中透析过夜；透析后加入5mg/mL NaBH4溶液，再加入等量的饱和硫...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙远明，董秀秀，徐振林，陈子键，雷红涛，杨金易，王弘，沈玉栋，罗林，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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