生物分子的纯化制造技术

本发明专利技术涉及改良的纯化生物分子的方法和系统，其中所述方法可以以连续方式进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物分子的纯化相关申请本申请要求提交日期为2012年6月29日的美国临时专利申请第61/666,521号、提交日期为2012年6月29日的美国临时专利申请第No.61/666,561、提交日期为2012年6月29日的美国临时专利申请第61/666,329号以及提交日期为2012年7月2日的欧洲专利申请EP12004909.3的优先权，各自整体援引加入本文。
本专利技术提供用于纯化包括治疗抗体和包含Fc的蛋白在内的生物分子的创造性和高效的方法和系统。
技术介绍
生物分子，例如包括抗体、肽或激素在内的治疗蛋白的高效和经济的大规模生产对于生物技术和制药工业是越来越重要的考虑因素。一般来说，纯化过程相当复杂和昂贵，并且包括许多不同步骤。通常，利用细胞培养方法产生蛋白，例如，利用重组工程化以产生所关注的蛋白的哺乳动物或细菌细胞系。一般来说，靶蛋白表达之后，其与一种或多种杂质如宿主细胞蛋白、培养基组分和核酸的分离提出了艰巨的挑战。如果治疗蛋白是用于人，则这样的分离和纯化尤其重要，并且必须由监管机构如食品和药物管理局(FDA)批准。现在用于纯化蛋白的常规方法通常至少包括以下步骤：(a)用于去除细胞和细胞碎片的澄清步骤，例如利用差速离心和/或过滤；以及(b)一个或多个下游色谱步骤以分离所关注的蛋白与澄清的细胞培养进料中的各种杂质。虽然发酵和细胞培养过程可以以分批或补料分批模式或者连续(例如连续灌注过程的形式)运行，下游纯化过程通常作为批过程(常常甚至物理和逻辑分离)运行。在每个加工步骤之间，通常将样品储存在盛放或汇集罐(pooltank)或者储液器中以改变溶液条件，以便使其适合下一加工步骤。结果，需要大容器以储存中间产物。这导致高成本以及非常有限的制造灵活性和机动性。此外，进行许多分离批加工步骤是劳动力和成本密集以及耗时的。在单克隆抗体的情况下，纯化方法的行业标准通常包括“模板化”方法，其包括几个单元操作。单元操作之一是纯化步骤，其采用称作A蛋白、分离自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)并结合抗体的Fc区的亲和配体。额外的单元操作通常与A蛋白单元操作联用，并且大部分生物制药公司采用使用单元操作非常相似的方法模板，而单元操作的顺序可以有一些变化。现在工业中使用的示例性模板化方法在图1中示出。这个模板的关键方面是细胞收获步骤，其通常包括使用离心以从细胞培养液去除细胞和细胞碎片，然后进行深层过滤。细胞收获步骤之后通常是A蛋白亲和纯化步骤，然后是病毒灭活。病毒灭活之后通常是一个或多个色谱步骤，也称作抛光步骤，其通常包括一个或多个阳离子交换色谱和/或阴离子交换色谱和/或疏水相互作用色谱和/或混合模式色谱和/或羟基磷灰石色谱。抛光步骤之后是病毒过滤和超滤/渗滤，这完成模板化方法。参见例如，Shuklaetal.,J.ChromatographyB.,848(2007)28-39；Liuetal.,MAbs,2010:Sep-Oct2(5):480-499。一般来说，在中间体汇集罐中收集过滤操作的流出液和色谱操作的洗脱物并经常储存过夜，直至下一单元操作。完成这个过程所需要的时间可以长达4-7天。本专利技术提供改良的模板化方法，其克服目前工业使用的模板化方法的几个缺点。
技术实现思路
本专利技术提供方法和系统，其提供优于现在工业中使用的典型模板化方法的几个优势。本文所述的模板化方法和系统包括以连续或半连续方式连接的单元操作，并且排除了通常使用储存罐的某些单元操作之间对汇集罐(也称作储存罐)的需要。或者，仅采用缓冲罐。由于某些加工步骤的特定组合，本文所述的方法和系统需要比工业中使用的典型方法更少的步骤，并且还显著地减少总纯化过程的时间而对产物收率没有不利影响。在本专利技术的一方面，提供从样品纯化靶分子的方法。在一些实施方案中，这样的方法包括以下步骤：(a)提供包含靶分子以及一种或多种杂质的样品；(b)将至少一种沉淀剂添加至所述样品并去除一种或多种杂质，从而回收澄清的样品；(c)使来自步骤(b)的澄清的样品进行包含至少两个分离单元的结合和洗脱色谱步骤，每个分离单元包含相同的介质，从而获得包含所述靶分子的洗脱物；以及(d)使所述洗脱物进行流过纯化，所述流过纯化包括使用两种或更多种介质；其中至少两个步骤在它们的至少一部分持续时间中同时进行，并且其中所述方法包含单一的结合和洗脱色谱步骤。在一些实施方案中，在整个方法中液体的流动是连续的，即所述方法为连续方法。在一些实施方案中，所述方法在上文的步骤(c)和(d)之间包括病毒灭活步骤。如本文所述，病毒灭活步骤包括使用选自酸、去污剂、溶剂的病毒灭活剂和温度变化。在一些实施方案中，病毒灭活步骤采用一个或多个在线(in-line)静态混合器。在其他实施方案中，病毒灭活步骤包括使用一个或多个缓冲罐。在一些实施方案中，靶分子为抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，本文所述方法中采用的沉淀剂为刺激响应性聚合物。优选的刺激响应性聚合物为改性的聚烯丙基胺聚合物，其对磷酸盐刺激响应。其他示例性沉淀剂包括但不限于例如酸、辛酸、絮凝剂和盐。在一些实施方案中，添加沉淀剂之后采用一个或多个深层滤器去除杂质。在其他实施方案中，采用离心去除一种或多种杂质。沉淀并去除一种或多种杂质之后，使澄清的样品进行单一的结合和洗脱色谱步骤，例如上文提到的步骤(c)，其通常采用至少两个分离单元。在一些实施方案中，结合和洗脱色谱步骤采用连续多柱色谱(CMC)。在一优选实施方案中，结合和洗脱色谱步骤为亲和色谱步骤(例如，A蛋白亲和色谱)。在其他实施方案中，结合和洗脱色谱步骤包括使用阳离子交换(CEX)结合和洗脱色谱步骤或者混合模式色谱步骤。在一些实施方案中，结合和洗脱色谱步骤(例如，A蛋白亲和色谱)在装载步骤中采用添加剂，从而导致减少或消除使用的中间洗涤步骤的数量。示例性添加剂包括盐、去污剂、表面活性剂和聚合物。在一些实施方案中，添加剂为盐(例如，0.5MNaCl)。在一些实施方案中，起始样品为细胞培养物。这样的样品可以在生物反应器中提供。在一些实施方案中，样品在除生物反应器以外的容器中提供，例如，如本文所述，可以在进行纯化过程之前将其从生物反应器转移至另一容器。在一些实施方案，将上文步骤(b)中使用的沉淀剂直接添加至包含细胞培养物的生物反应器中。在其他实施方案中，将沉淀剂添加至除生物反应器以外的容器，其中所述容器包含含有靶分子的样品。在一些实施方案中，利用静态混合器添加沉淀剂。在一些优选实施方案中，本文所述的方法包括流过纯化过程操作，其采用两种或更多种选自以下的介质：活性炭、阴离子交换色谱介质和阳离子交换色谱介质。在一些实施方案中，这样的流过纯化操作额外地包括病毒过滤步骤，其采用病毒过滤膜。本文所述的方法避免需要在各个加工步骤之间使用汇集罐。在一些实施方案中，本专利技术的方法包括使用一个或多个缓冲罐。本文所述的方法可以额外地包括配制步骤。在一些实施方案中，这样的配制步骤包括渗滤、浓缩和灭菌。如上文所述，本文所述的方法包括流过纯化操作，其通常采用两种或更多种介质。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的流过纯化过程操作包括以下步骤，其中所有步骤均以流过模式进行：(a)使来自A蛋白色谱柱的洗脱物与活性炭接触；(b)使来自步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含所述靶分子以及一种或多种杂质的样品；b)将至少一种沉淀剂添加至所述样品并去除一种或多种杂质，从而回收澄清的样品；c)使来自步骤(b)的澄清的样品进行包含至少两个分离单元的结合和洗脱色谱步骤，从而获得包含所述靶分子的洗脱物；以及d)使所述洗脱物进行流过纯化，所述流过纯化包括使用两种或更多种介质；其中至少两个步骤在它们的至少一部分持续时间中同时进行，并且其中所述方法仅包括一个结合和洗脱色谱步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.02 EP 12004909.3;2012.06.29 US 61/666,521;1.一种纯化抗体的连续方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含所述抗体以及一种或多种杂质的样品；(b)将至少一种沉淀剂添加至所述样品并去除一种或多种杂质，从而回收澄清的样品；(c)使来自步骤(b)的澄清的样品进行包含至少两个分离单元的结合和洗脱色谱步骤，从而获得包含所述抗体的洗脱物；以及(d)使所述洗脱物进行流过纯化，所述流过纯化包括使用两种或更多种介质，介质中的一种为活性炭且其他的介质选自阴离子交换色谱介质和阳离子交换色谱介质，其中至少两个步骤在它们的至少一部分持续时间中同时进行，其中所述方法仅包括一个结合和洗脱色谱步骤，其中所述方法包括使用一个或多个缓冲罐和/或一个或多个静态混合器，其中所述流过纯化操作按照以下顺序进行：活性炭，然后是阴离子交换色谱介质，然后是阳离子交换色谱介质，并且其中在所述阴离子交换色谱介质和所述阳离子交换色谱介质之间采用在线静态混合器和/或缓冲罐以改变pH。2.权利要求1的方法，所述方法在步骤(c)和(d)之间包括病毒灭活步骤。3.权利要求2的方法，其中所述病毒灭活步骤包括使用选自溶剂的病毒灭活剂和温度变化。4.权利要求2的方法，其中所述病毒灭活步骤包括使用选自酸和去污剂的病毒灭活剂。5.权利要求2的方法，其中病毒灭活步骤包括使用一个或多个在线静态混合器。6.权利要求2的方法，其中病毒灭活步骤包括使用一个或多个缓冲罐。7.权利要求1的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体或多克隆抗体。8.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的沉淀剂为刺激响应性聚合物。9.权利要求8的方法，其中所述刺激响应性聚合物为改性的聚烯丙基胺聚合物。10.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的沉淀剂选自酸、絮凝剂和盐。11.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的沉淀剂选自辛酸。12.权利要求1的方法，其中步骤(b)中去除杂质包括使用一个或多个深层滤器。13.权利要求1的方法，其中步骤(b)中去除杂质包括使用离心。14.权利要求1的方法，其中步骤(c)中的结合和洗脱色谱步骤采用连续多柱色谱。15.权利要求1的方法，其中步骤(c)中的结合和洗脱色谱步骤选自亲和色谱、阳离子交换色谱和混合模式色谱。16.权利要求1的方法，其中步骤(c)中的结合和洗脱色谱步骤采用A蛋白亲和色谱。17.权利要求16的方法，其中A蛋白亲和色谱采用偶联至选自以下的基质的A蛋白配体：刚性亲水性聚乙烯醚聚合物、可控多孔玻璃和琼脂糖。18.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的样品为细胞培养物。19.权利要求18的方法，其中在生物反应器中提供所述细胞培养物。20.权利要求19的方法，其中所述生物反应器为一次性使用的生物反应器。21.权利要求18的方法，其中在除生物反应器以外的容器中提供所述细胞培养物。22.权利要求1的方法，其中将步骤(b)中的沉淀剂添加至包含细胞培养物的生物反应器中。23.权利要求22的方法，其中利用静态混合器添加所述沉淀剂。24.权利要求1的方法，其中将步骤(b)中的沉淀剂添加至除生物反应器以外的包含样品的容器，所述样品包含所述抗体。25.权利要求1的方法，其中步骤(d)中的流过纯化还包括使用病毒过滤膜。26.权利要求1的方法，其中所述阳离子交换色谱介质为膜、珠或纤维形式。27.权利要求1的方法，其中所述方法包括使用一个或多个缓冲罐，并且在加工步骤之间不采用任何汇集罐。28.权利要求1的方法，其还包括配制步骤。29.权利要求28的方法，其中配制包括渗滤、浓缩和无菌过滤。30.一种从A蛋白洗脱物纯化抗体的连续方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含抗体以及一种或多种杂质的样品；(b)使所述样品澄清以去除一种或多种杂质且回收澄清的样品；(c)使所述澄清的样品进行A蛋白结合和洗脱色谱步骤以获得A蛋白洗脱物；(d)使回收自A蛋白色谱柱的洗脱物与活性炭接触；(e)使来自步骤(d)的流过样品与阴离子交换色谱介质接触；以及(f)使来自步骤(e)的流过样品与阳离子交换色谱介质接触；以及(g)获得来自步骤(f...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·克赛诺普洛斯，M·菲利普斯，W·莫亚，J·贾比尔，M·科兹洛夫，A·波蒂，M·T·斯通，W·卡塔尔多，C·希列斯彼，
申请(专利权)人：EMD密理博公司，
类型：发明
国别省市：美国;US