一种植物营养贮存蛋白（GmVSPB）基因，属于遗传工程技术领域，其特征在于以大豆东农50子叶节为材料，在细胞分裂素6-BA诱导下，抑制消减杂交出差异基因，以期获得再生相关基因并进行基因克隆，利用农杆菌介导的方法转化植物，观察转基因植株的变化，通过定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研究细胞分裂素对再生的影响；从子叶节器官发生途径结合激素对大豆再生途径相关转录因子基因的表达影响入手，分析再生基因在再生体系中的作用，寻找到一种大豆植物营养贮存蛋白（GmVSPB）基因（Seq ID No:1）。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物营养贮存蛋白（GmVSPB)基因，属于遗传工程
技术介绍
大豆是我国重要的粮食和油料作物，但面对耕地面积日益缩减，粮食安全问题日 益凸显的情况，要摆脱我国大豆供给紧张，解决大豆依赖进口的严峻局面，必须要加快分子 育种研宄的步伐，争取在短期内大幅度提高我国大豆的单产和总产水平。而生物技术是分 子育种的主要手段，生物技术在大豆育种中应用的一个关键保障就是高效稳定的再生体 系。由于大豆再生受基因型影响，只有少数大豆品种的再生体系比较稳定，因此阻碍了生物 技术在多数大豆品种中的应用。 抑制消减杂交技术（SSH, Suppression Subtractive Hybridization)是分离 克隆差异表达基因的一种新方法，由Diatchenko等人于1996年提出的，结合了抑制PCR (Suppression PCR)技术和消减杂交法而建立的。抑制消减杂交技术（SSH)是鉴定、分离细 胞组织中的选择性差异表达基因的一种方法，原理是以抑制性PCR为基础的cDNA消减杂 交技术(唐江云，张涛，郑家奎，2009)，经过抑制消减杂交后的cDNA群体不仅富集了差 异表达基因，而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除，消减后获得的cDNA 群体即为丰度一致的目的基因群体(王芳，2011)。SSH技术已被国内外广泛应用于动物和植 物研宄领域。 大豆的组织培养研宄始于20世纪60年代，但到80年代中、后期建立了组织、细 胞、原生质体水平的植株再生技术，大豆组织培养工作真正进入了发展阶段。大豆组织培养 的外植体除了原生质体和单细胞以外，常用的还有胚、子叶、子叶节、真叶及下胚轴等，有两 种诱导途径：一种是器官发生途径，即通过外植体的诱导产生不定芽（或称丛生芽），之后 芽形成不定根，最后形成完整植株；另一种体细胞胚胎发生途径，是诱导体细胞胚胎发生， 胚萌发成再生植株。1993年，Christianson等（1993)以幼胚为外植体诱导体细胞胚胎发 生，首次获得了再生植株。随着研宄的发展，后来采用的外植体多为未成熟胚、下胚轴和现 在被广泛应用于转化的子叶节。将这些外植体培养在添加不同种类和浓度的细胞分裂素的 培养基上诱导产生不定芽后再生植株，培养基主要是MS或B5基本培养基，常用的植物激 素有6-BA、NAA、IBA和IAA等，集中研宄基因型、培养基类型、激素浓度及外植体种类等对 不定芽形成的影响。至今为止，以成熟胚子叶、子叶节和幼胚轴等作为外植体的再生体系已 经成功获得再生大豆植株。由于大豆器官发生的外植体具有来源广、组织培养时间短等特 点，因此仅用3个月即可得到再生大豆植株，这样得到的再生植株嵌合体居多，筛选难度很 大，使得鉴定、筛选传代和纯化再生大豆植株的工作量大大地加大了。 在20世纪80年代，人们发现了一种专门的贮藏蛋白，广泛存在于营养器官中，区 别于种子IC藏蛋白，称为植物营养IC存蛋白（vegetative storage proteins, VSP)，这种 贮藏蛋白首先是在树木中发现的，是作为植物氮源的贮存形式而被人们认识。大豆的VSP 最早是从叶中鉴定出来，也以大豆叶中的营养贮藏蛋白质研宄得最为深入。大豆是世界上 公认的难转化的作物，大豆的高效遗传转化也一直是植物基因工程领域的难点之一。国内 外相继报道了以大豆不同组织为外植体，通过器官发生或胚胎发生以及从原生质体培养获 得成功的再生植株，但突破性的进展却很少，即转化率还没有显著提高。这种情况大大影响 了大豆转基因技术的应用，所以大豆转基因技术研宄的重心应该转移到大豆高效再生体系 的建立及大豆再生相关基因发生机理和调控因子方面，通过优化再生条件及分析再生基因 的功能进而提高大豆的再生能力，为建立高效、稳定的再生体系和遗传转化体系奠定基础。 再生相关基因还能够以一种新型无争议的生物安全标记基因来替代抗生素、除草剂等选择 标记，在导入外源目的基因的同时提高受体植物的再生能力，对植物转基因育种效率及转 基因新品种的安全性具有重要意义。目前，虽然对植物的再生相关基因的研宄较少，但在模 式植物拟南芥、水稻等植物中已有一些调控再生相关的转录因子或基因的研宄和报道，可 为本研宄奠定一定的理论保证。关于植物再生相关基因的克隆在国内外报道甚少，而大豆 再生相关基因的克隆更是未见报道，因此，如何通过现代分子生物学技术从根本上提高大 豆的再生能力，找到控制大豆再生的基因，解决大豆再生体系建立难、转化难成为急需解决 的一大难题？所以以大豆东农50子叶节为材料，在细胞分裂素6-BA诱导下，抑制消减杂交 出差异基因，获得再生相关基因并进行基因克隆，利用农杆菌介导的方法转化植物，观察转 基因植株的变化，通过定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研宄细胞分裂素对再生的影 响；从子叶节器官发生途径结合激素对大豆再生途径相关转录因子基因的表达影响入手， 分析再生基因在再生体系中的作用，寻找再生基因并对基因进行克隆和改造；从分子水平 上分析基因的功能并研宄其作用机理，为发掘大豆再生基因，提高大豆的再生和遗传转化 效率，专利技术一种植物营养贮存蛋白（GmVSPB)基因是必要的。
技术实现思路
为了通过现代分子生物学技术试图从根本上提高大豆的再生能力，解决大豆再生 体系建立难、转化难的难题，本专利技术提供了一种植物营养贮存蛋白（GmVSPB)基因，该专利技术以 大豆东农50子叶节为材料，在细胞分裂素6-BA诱导下，抑制消减杂交出差异基因，以期获 得再生相关基因并进行基因克隆，利用农杆菌介导的方法转化植物，观察转基因植株的变 化，通过定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研宄细胞分裂素对再生的影响；从子叶节 器官发生途径结合激素对大豆再生途径相关转录因子基因的表达影响入手，分析再生基因 在再生体系中的作用，寻找到大豆植物营养贮存蛋白（GmVSPB)基因 （Seq ID No: 1)。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是： 本专利技术的一种一种植物营养贮存蛋白（GmVSPB)基因，其特征在于采用抑制消减杂交法 获得GmVSPB基因 （Seq ID No: 1)。具体步骤如下： 本专利技术的一种植物营养贮存蛋白（GmVSPB)基因，其特征在于采用抑制消减杂交法 获得GmVSPB基因 （Seq ID No: 1)。具体步骤如下：①抑制消减杂交法：首先，获得大豆子 叶节并用6-BA处理；接着，用RNAiso Plus的方法提取大豆子叶节的总RNA，采用SMART (Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript)技术合成cDNA，纯化双链cDNA， 纯化RsaI酶切及其产物，接头连接，杂交，分析消减杂交后两次PCR扩增的结果，纯化PCR 产物，构建抑制消减杂交文库，最后，克隆基因 （Seq ID No: 1)并对其序列分析。 ②GmVSPB基因的生物信息学分析（Seq ID No:2)。③GmVSPB基因的植物表达载体构建。 ④中间载体的构建。⑤GmVSPB植物表达载体转化农杆菌：利用冻融法将物表达载体质粒转 入农杆菌菌株。转化后挑取单菌落摇菌，提取质粒。通过PCR扩增获得条带大小为977bp， 表明成功将表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物营养贮存蛋白（GmVSPB）基因，其特征在于采用抑制消减杂交法获得GmVSPB基因（Seq ID No:1）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏安玉，武小霞，孙晶，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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