一种红曲菌代谢产物的制备方法技术

一种红曲菌代谢产物的制备方法，采用红曲菌PHDS26液态发酵获得的菌丝体，再从菌丝体中提取、分离、纯化得到Monascopyridine A和Monascopyridine B。本发明专利技术可使得MCA和MCB的产量分别达到2.07和1.96g/kg。比现有技术的提取率提高了约50％；本发明专利技术采用的HPLC分析方法不需要进行梯度洗脱，样品提取过程中不需要添加磷酸，操作较简便，且MCA和MCB的保留时间短。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
涉及天然活性产物的制备。
技术介绍
红曲是我国的传统发酵产品，在我国一直被认为具有药用和食用双重功效，不仅是祖国宝贵的科学文化遗产，而且在世界微生物史上具有重要意义。20世纪30年代，自红曲流传到了欧美以后，世界各国都开始研宄红曲菌的分类与鉴定、红曲色素的提取工艺优化及其在生产中的应用，并对红曲发菌酵组分的分离纯化、结构表征及代谢机理等方面进行了一些研宄，但进展较慢。最近几十年，随着微生物学的发展、分析方法的进步和分析仪器的更加精确，国内外的学者对红曲菌的发酵进行了大量广泛而深入的研宄，在红曲色素分离、结构鉴定、菌种改良、液态发酵工艺优化、代谢产物基因调控、功能性及安全性等理论和应用方面的研宄都卓有成效，不断拓展着红曲色素的应用领域。近年来，随着对红曲中生物活性物质研宄不断发展，各国学者对其进行深入而广泛研宄，发现红曲能产生许多令人瞩目次级代谢产物，如红曲色素、胆固醇抑制剂、及具有降血压、抗菌、降血氨、抗肿瘤、降血糖等生理活性成分，使传统红曲增添新的内涵。一种天然物质能同时具有多项生物活性实属罕见，因此开发红曲新功能现已成为各国研宄热点之一。红曲菌两种代谢产物Monascopyridine A(MCA)和 Monascopyridine B(MCB)是由德国科学家 Wild 等(Wild D, et al.New Monascus metabolites with a pyridinestructure in red fermented rice.J Agric Food Chem, 2003, 51, 5493 - 5496)首次在红曲米或以红曲米粉为发酵培养基进行液态发酵得到的，并对其结构进行了表征，然而，对MCA和MCB的分离方法和生物活性未做具体研宄。目前，我们发现橙色红曲菌AS3.4384在敲除 pksCT 基因后得到的 PHDS26 菌株(Fu G, Xu Y, et al.Construct1n of a replacementvector to disrupt pksCT gene for the mycotoxin citrinin b1synthesis inMonascus aurantiacus and maintain food red pigment product1n.Asia Pac J ClinNutr, 2007, 16 (SI)，137-142 ;付桂明；橙色红曲菌pksCT gene的敲除和长同源臂置换型打靶载体的构建;南昌大学；2007年)，MCA和MCB的产量大大提高，且原始菌株AS3.4384几乎不产MCA和MCB。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供红曲菌代谢产物MCA和MCB的制备方法。本专利技术提供橙色红曲菌AS3.4384几乎不产MCA和MCB，然而在敲除pksCT基因后，MCA和MCB的产量大大提高，分别达到2.07和1.96g/kgo本专利技术所述的红曲菌代谢产物MCA和MCB的制备方法，包括如下步骤:(I)红曲菌孢子悬液的制备。将橙色红曲菌株AS3.4384和其pksCT基因缺失株PHDS26分别接种到MPPY液体培养基中(4%葡萄糖，0.2%酵母浸膏，0.3% NaNO3,0.05% KC1，pH 6.8)，恒温摇床培养2?4d，120?250r/min，28?35°C ;用移液枪吸取ImL培养液接种在MES固体培养基上28?30°C培养10?12d ;长出大量孢子后，用孢子洗液洗脱孢子；500目的双层尼龙布过滤后得到均一的孢子悬液。(2)菌丝和发酵液的收集。对菌株AS3.4384和PHDS26的孢子悬液进行适当的稀释后分别接种到50mL YES液体培养基(I?10%酵母浸膏，2?30%蔗糖)，摇匀，培养基中的孢子终浓度为(I?10) X 13个/mL，30°C静置培养16?26d。发酵结束后，取出三角瓶，用滤纸将菌体和发酵液过滤，收集发酵液，将湿菌体在60°C下烘干后研碎，收集干燥的菌体，研磨成粉后备用。(3) MCA和MCB的提取与初分离。菌丝体粉末用超声波辅助提取，提取条件:60?100%甲醇、30?60°C、10?30min、固液比1:25 (w/v, kg/L)，两者提取液皆8000r/min离心20min，收集提取液，提取液在60°C下旋转蒸发，浓缩至干，残渣用乙酸乙酯复溶得到初提液，作硅胶柱分离用。采用硅胶柱层析法对样品进行初步分离，称取一定量的200-300目的硅胶，加入正己烷:乙酸乙酯(7:3，v/v，L/L)用玻璃棒充分搅拌，装柱；沉降完成后，将一定量的初提液上样，用正己烷:乙酸乙酯(7:3，v/v, L/L)洗涤，收集洗脱液，60°C浓缩至干，加入乙醇复溶，用本专利技术的技术效果中的HPLC方法检测，以确定含有目标产物的溶液，待收集到一定量后，旋转浓缩至干，用无水乙醇复溶，0.22 μ m微孔滤膜过滤，备用。(4) MCA 和 MCB 的纯化。采用半制备高效液相色谱法对MCA和MCB进行纯化，半制备型HPLC条件为:色谱柱:Zorbax SB-C18 (9.4X 150mm, 5 μ m);流动相:乙腈 / 水(75:25, v/v,mL/mL);检测波长:300nm ;温度:室温(25°C );样量:200 μ I。分别收集两种目标产物洗脱液，并将两者的洗脱溶液于60°C下旋转蒸发浓缩至干，得到纯度大于95%的MCA和MCB。本专利技术MCA和MCB的生物活性测定。采用MTT法检测了 MCA和MCB对H印G2细胞增殖抑制的影响，结果显示，MCA和MCB能明显抑制H印G2细胞的增殖，MCA和MCB对H印G2细胞抑制的IC5tl值分别为40.0和20.0 μ g/mL0发酵液用同体积的甲醇萃取，菌丝用超声波辅助提提取，提取条件:60?100%甲醇、30?60。。、10?30min、固液比1:25，两者提取液皆8000r/min离心20min，0.22 μπι微孔滤膜过滤后用HPLC检测两种代谢产物。HPLC测定条件经过优化如下:色谱柱:Hypersil0DS-2 (5 μ m，250 X 4.6mm，Thermo 公司)；流动相:乙腈-水(60:40，v/v);检测波长:300nm ;柱温:25°C ;流速:0.8mL/min ;进样量:20yLo本专利技术的技术效果:目前文献报道(Wild D, et al.New Monascusmetabolites with a pyridine structure in red fermented rice.J Agric FoodChem, 2003, 51，5493 - 5496.)中采用大米或大米粉发酵得到该红曲菌代谢产物，通过本专利技术的方法采用红曲菌PHDS26液态发酵获得的菌丝体，使得MCA和MCB的产量分别达到2.07和1.96g/kg。本专利技术采用超声波辅助提取，优化后的提取条件:90%甲醇、40°C、20min、固液比1:25 (w/v, kg/L)，比上述文献报道的提取方法(采用乙腈作为提取剂)提取率提高了约50%。另外，本专利技术采用的HPLC分析方法不需要进行梯度洗脱，样品提取过程中不需要添加0.25M的磷酸，操作较上述文献简便，且MCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红曲菌代谢产物的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)红曲菌孢子悬液的制备：将橙色红曲菌株AS3.4384和其pksCT基因缺失株PHDS26分别接种到4％葡萄糖、0.2％酵母浸膏、0.3％NaNO3、0.05％KCl、pH 6.8的MPPY液体培养基中，恒温摇床培养2～4d，120～250r/min，28～35℃；用移液枪吸取1mL培养液接种在MES固体培养基上28～30℃培养10～12d；长出大量孢子后，用孢子洗液洗脱孢子；500目的双层尼龙布过滤后得到均一的孢子悬液；(2)菌丝和发酵液的收集：对菌株AS3.4384和PHDS26的孢子悬液进行适当的稀释后分别接种到50mL YES液体培养基，培养基中含1～10％酵母浸膏、2～30％蔗糖；摇匀，培养基中的孢子终浓度为(1～10)×103个/mL，30℃静置培养16～26d；发酵结束后，取出三角瓶，用滤纸将菌体和发酵液过滤，收集发酵液，将湿菌体在60℃下烘干后研碎，收集干燥的菌体，研磨成粉后备用；(3)Monascopyridine A和Monascopyridine B的提取与初分离：菌丝体粉末用超声波辅助提提取，提取条件：60～100％甲醇、30～60℃、10～30min、固液比(kg/L)1:25，两者提取液皆8000r/min离心20min，收集提取液，提取液在60℃下旋转蒸发，浓缩至干，残渣用乙酸乙酯复溶得到初提液，作硅胶柱分离用；采用硅胶柱层析法对样品进行初步分离，称取一定量的200‑300目的硅胶，加入正己烷:乙酸乙酯(L/L)7:3用玻璃棒充分搅拌，装柱；沉降完成后，将一定量的初提液上样，用正己烷:乙酸乙酯(L/L)7:3洗涤，收集洗脱液，60℃浓缩至干，加入乙醇复溶，检测，以确定含有目标产物的溶液，待收集到一定量后，旋转浓缩至干，用无水乙醇复溶，0.22μm微孔滤膜过滤，备用；(4)Monascopyridine A和Monascopyridine B的纯化：采用半制备高效液相色谱法对Monascopyridine A和Monascopyridine B进行纯化，半制备型HPLC条件为：色谱柱：Zorbax SB‑C18：9.4×150mm，5μm；流动相：乙腈/水(mL/mL)75:25；检测波长：300nm；温度：室温25℃；样量：200μl；分别收集两种目标产物洗脱液，并将两者的洗脱溶液于60℃下旋转蒸发浓缩至干，得到纯度大于95％的Monascopyridine A和Monascopyridine B。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志兵，许杨，苏保伟，李燕萍，涂追，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36