本发明专利技术公开了一种β‑分泌酶特异性抑制剂的筛选体系，该体系为微胶束溶液包裹带有荧光标记的APP蛋白形成的微胶束‑APP体系；所述APP蛋白为淀粉样前体蛋白；所述微胶束溶液采用经过两亲性聚合物分子修饰的量子点制得；所述带有荧光标记的APP蛋白是利用正交反应体系，对APP蛋白进行定点荧光标记制得。此外，本发明专利技术还公开了一种β‑分泌酶特异性抑制剂的筛选方法。本发明专利技术以BACE天然底物分子作为靶标，保证了筛选到的药物前导分子具有更精确的底物特异性，可实现灵敏的实时监测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种抑制剂的筛选方法及其筛选系统，特别是设及一种0-分泌酶 炬AC巧特异性抑制剂的筛选方法及其筛选系统。
技术介绍
已有大量证据表明淀粉样蛋白（A0)在中枢系统的异常聚集和沉积有神经毒性， 并可导致阿尔兹海默（Alzheimer'S)病的发生。A0是通过0-分泌酶炬AC巧和丫-分 泌酶对淀粉样前体蛋白（APP蛋白）的逐步水解作用形成的。其中，BACE是A0生成的限速 步骤。针对BACE的抑制剂被认为是最有希望成为治疗和预防Alzheimer's病的药物。全 球多家制药公司正围绕BACE抑制剂的筛选开展激烈的竞争。人们通过结构分析W及分子 设计，已经获得了数W万计的有希望成为BACE抑制剂的化合物分子。但如何从中筛选到能 有效抑制BACE水解APP产生A0的活性，又不影响BACE的其他正常生理活性的真正有意 义的前导药物，成为困扰BACE抑制剂研究的难点。[000引 目前BACE抑制剂的筛选方法，基本都是利用BACE酶切位点的多肤序列为底物。在 酶切位点的中间引入巧光泽灭基团，多肤的一端引入巧光基团，根据巧光共振能量转移原 理，巧光基团的发射光被泽灭基团吸收。多肤在BACE酶切作用下两种基团分离，巧光基团 的发射光可被检测到。 然而由于多肤不具有空间结构，不能完全反应蛋白底物与蛋白酶相互作用时的选 择性。因此，W多肤为底物筛选到的BACE抑制剂，往往不具备选择性，它们会对BACE的蛋 白酶活性不加区别地抑制。该势必造成该些抑制剂在阻断A0产生的同时，影响了BACE对 其它底物的正常加工作用。或者会影响BACE同一家族的其它蛋白酶的活性。该些都会导 致严重的副作用。 ChengquanZhang等人报道(ChengquanZhang,LiZheng,etal.Cleavage ofpro-tumornecrosisfactoralphabyADAMmetallopeptidasedomain17:Af； iprescemce-basedproteaseassaycleavesitsnaturalproteinsubstrate. Anal}fticalBiochemistry, 2014 445:14-19;)利用TACE的天然底物TNFa为勒1 标，可W筛选到通过抑制TNFaS聚体形成而阻断TACE-TNFa加工途径的化合物，该种化合物并不 影响TACE对其多肤底物的酶切活性。证明了用蛋白质做底物可W提高化合物筛选的精确 度。 因此，对0 -分泌酶特异性抑制剂的筛选方法有待进一步研究的价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种0 -分泌酶特异性抑制剂的筛选体系。 本专利技术要解决的技术问题之二是提供一种0 -分泌酶特异性抑制剂的筛选方法。 该筛选方法是根据巧光共振能量转移原理，用带有量子点标记的微胶束包装带有 巧光定点标记的淀粉样前体蛋白（APP蛋白）。微胶束一方面可W维持APP蛋白空间构象， 另一方面又可W对APP蛋白起拘束作用，从而使得量子点和APP蛋白之间可形成巧光共振 能量转移。该种能量转移将会由于BACE对APP蛋白的酶切，APP蛋白带有巧光标记的部分 与胶束的分离而消失。因此，可W通过记录巧光信号，实时定量检测各种化合物对BACE作 用的影响。本专利技术的特征是，WBACE天然底物分子作为祀标，保证了筛选到的药物前导分 子具有更精确的底物特异性。 为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案： 在本专利技术的一方面，提供一种0-分泌酶特异性抑制剂的筛选体系，该体系为微 胶束溶液包裹带有巧光标记的APP蛋白形成的微胶束-APP体系；所述APP蛋白为淀粉样前 体蛋白；所述微胶束溶液采用经过两亲性聚合物分子修饰的量子点制得；所述带有巧光标 记的APP蛋白是利用正交反应体系，对APP蛋白进行定点巧光标记制得。 进一步地，所述两亲性聚合物分子，是WC18长烧姪链为骨架，接枝上带有亲水性 头部的两亲性分子；亲水性头部包括；多己胺，聚丙締酸，短链多聚极性氨基酸，乳糖，甘露 醇；所述量子点是一种巧光纳米颗粒，包括II-VI族油相合成量子点，该量子点的粒径为 5nm~lOnm，发射波长控制在490nm~510nm。 进一步地，所述微胶束溶液中的微胶束的粒径范围为100~200nm;;所述带有巧 光标记的APP蛋白与所述微胶束溶液W表面活性剂分子计算的摩尔比为1 ; 1~1:10 ;所述 巧光标记包括激发波长范围与量子点发射波长范围重叠的巧光核。 在本专利技术的另一方面，提供一种0-分泌酶特异性抑制剂的筛选方法，包括如下 步骤： 1)用经过两亲性聚合物分子修饰的量子点制备微胶束溶液（即量子点微胶束溶 液）； 2)利用正交反应体系，对淀粉样前体蛋白（APP蛋白）进行定点巧光标记； 3)用步骤1)的微胶束溶液包裹步骤2)的带有巧光标记的APP蛋白，W形成微胶 束-APP体系；[001引 4)利用微胶束-APP体系筛选具有BACE活性抑制作用的化合物。 进一步地，所述步骤1)中，量子点是一种巧光纳米颗粒，本专利技术采用易于制备，且 巧光效率高的II-VI族油相合成量子点，如CdTe、CdSe、CaS、CaSe、BaS、BaTe等；该量子点 的制备方法，可根据常规的方法进行制备。另外，本专利技术中的量子点的粒径优选为5nm~ lOnm，发射波长控制在490nm~510nm。 步骤1)中，量子点表面修饰所使用的两亲性聚合物分子，是WC18长烧姪链，如脑 磯脂等为骨架，接枝上带有亲水性头部的两亲性分子。亲水性头部包括；多己胺，聚丙締酸， 短链多聚极性氨基酸，乳糖，甘露醇等。接枝方法；取长烧姪链分子溶于二甲基亚 讽值MS0)或二甲基甲酯氨值MF)中，加入8mM的N，N'-二环己基碳化二亚胺值CC)和8mM 的N-哲基了二酷亚胺（N服），0°C下反应12虹，使长烧姪分子活化。取0. 02mM~0. 74mM的极 性分子如聚丙締酸，半乳糖，甘露糖等溶于氯仿-甲醇溶液（V氯仿；V甲醇=3:1)中，缓慢 加热至35°C，逐渐滴加入到上述0. 04mM~ImM已活化好的烧姪分子溶液中，并加入3mMS 己胺，保持体系在35°C下反应12虹，即得到可用于量子点表面修饰的两亲性化合物分子。 步骤1)中，量子点标记的微胶束的合成具体操作可包括步骤：[002引将1ymol的量子点溶于氯仿-甲醇（V氯仿；V甲醇=3 ;1)的溶剂中，加入100~ 900倍摩尔数量的两亲性聚合物分子，在50~80°C下混合，并蒸发除去多余的有机溶剂。 将得到的固体分散到超纯水中，高速离屯、，取上清，除去团聚的、未被修饰的量子点。过滤上 清。 所述过滤中的滤膜包括；孔径为100~200nm的聚碳酸醋滤膜； 微胶束溶液中的微胶束的粒径范围优选为100~200nm。进一步地，所述步骤2)中，带有巧光定点标记的淀粉样前体蛋白，是通过基于密 码子拓展的生物正交标记系统完成的。如图4所示，具体的合成方法包括： a)构建含班巧抑制型tRNAiyScuA基因的质粒 提取嗜热古细菌基因组DNA，通过PCR的方法扩增获得班巧抑制型MjtRNAiys。。,的 基因，并将其克隆至含有大肠杆菌谷氨酷胺-tRNA启动子的且带有卡那霉素抗性的表达质 粒PAC123中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种β‑分泌酶特异性抑制剂的筛选体系，其特征在于：该体系为微胶束溶液包裹带有荧光标记的APP蛋白形成的微胶束‑APP体系；所述APP蛋白为淀粉样前体蛋白；所述微胶束溶液采用经过两亲性聚合物分子修饰的量子点制得；所述带有荧光标记的APP蛋白是利用正交反应体系，对APP蛋白进行定点荧光标记制得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪弋，郑莉，
申请(专利权)人：上海皓拓生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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