本发明专利技术提供利用鸡肉加工过程中的废弃器官-鸡头提取乙酰胆碱酯酶的方法。本发明专利技术是以鸡肉加工中的废弃器官-鸡脑为酶的材料来源，其工艺步骤包括：鸡脑的处理、匀浆液的制备、冷冻离心及粗提液的真空冷冻干燥，即可得到乙酰胆碱酯酶制品。由于传统酶源制得的产品成本高、产量低，而进口酶源价格昂贵，周期较长。本发明专利技术经酶源的筛选，充分利用了鸡肉加工过程中废弃器官鸡脑，高值化利用，降低了成本，且经优化及检验，酶活较高，粗酶液酶活可达到3.0～5.0U/mL，比活力可达到0.35～0.5U/mg，为后续乙酰胆碱酯酶纯品的制备提供了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酶的提取方法，具体涉及利用鸡肉加工过程中的废弃器官-鸡头 提取乙酰胆碱酯酶的方法。
技术介绍
乙酰胆碱醋酶（acetylcholinesterase，AChE)是胆碱能神经传导过程中至关重 要的一种酶，它能够快速水解神经递质乙酰胆碱（acetylcholine，ACh)成乙酸和胆碱，从 而终止ACh对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内正常传递。由于AChE对于 ACh的高速水解作用，使得其近年来得到越来越多的研宄人员的关注。AChE在生物防治、农 药残留检测、分子生物学以及各种神经性疾病治疗方面有广泛的应用。最近研宄表明，氨基 甲酸乙酯在一定程度上可以抑制AChE的活性，因此AChE有可能应用在氨基甲酸乙酯（EC) 的检测上。 AChE广泛存在于各种动植物组织中。目前，对于已经研宄过的动物，主要集中在肝 脏、血液和脑组织中，例如马血清，鲅鱼脑组织等。植物酯酶的研宄尚未深入，有一些研宄表 明，粮食作物中酶活相对较高，但是对于大部分的粮食原料来说，乙酰胆碱酯酶的提取同时 会造成粮食原料的浪费。由于酶源及制备工艺复杂等问题的存在，价格昂贵。因此需要探 索原料丰富、成本较低及酶活较高的酶源，以利于推进AChE在各个方面的应用研宄。而以 鸡肉加工中的废弃器官及组织提取乙酰胆碱酯酶，可以达到对废弃物的综合利用，又可以 实现原料的高值化。
技术实现思路
本专利技术提供，所 得产品可用于医药、葡萄酒和农残中有害成分氨基甲酸乙酯及其衍生物的检测等方面的应 用研宄。 本专利技术技术方案如下。 ，包括以下步 骤： (1)乙酰胆碱酯酶的制备： (1.1)将洗净烘干的表面皿称重，将新鲜的纵向斩开的鸡头用生理盐水冲洗干 净，用镊子将鸡脑取出至于表面皿中，去除非脑组织后再次称重； (1. 2)将鸡脑与含TritonX-IOO的磷酸盐缓冲液混合，得到混合液； (1. 3)将步骤（1. 2)所得混合液用匀浆机匀浆1~5min后，静置10~60min，得 到匀浆液； (1. 4)将匀浆液以3000~10000r/min，0~4°C离心10~30min，取其上清液，即 得乙酰胆碱酯酶粗提液； (I. 5)将步骤（I. 4)所得的乙酰胆碱酯酶粗提液的上清液置于表面皿中，进行真 空冷冻干燥，收集后即得乙酰胆碱酯酶制品； (2)乙酰胆碱酯酶酶活的测定： (2. 1)取0· 02~1.0 mg的乙酰胆碱酯酶制品，用蒸馏水溶解后，得到酶液，在IOmL 的比色管内，加入1~5mL磷酸盐缓冲液，再加入0. 01~0.1 mL酶液混匀，于25~60°C恒 温水浴锅中保温5~60min ; (2. 2)向加入0. 1~1.0 mL碘化硫代乙酰胆碱溶液和0. 1~1.0 mL DTNB溶液后混 匀； (2. 3)于400~500nm波长范围内用比色皿比色，记录吸光度，根据吸光度变化值 来计算酶活和比活力，比活力【主权项】1. ，其特征在于包括 以下步骤： (1) 乙酰胆碱酯酶的制备： (1. 1)将洗净烘干的表面皿称重，将新鲜的纵向斩开的鸡头用生理盐水冲洗干净，用镊 子将鸡脑取出至于表面皿中，去除非脑组织后再次称重； (1. 2)将鸡脑与含TritonX-IOO的磷酸盐缓冲液混合，得到混合液； (1. 3)将步骤（1. 2)所得混合液用匀浆机匀浆1~5min后，静置10~60min，得到匀 浆液； (1. 4)将匀浆液以3000~10000r/min，0~4°C离心10~30min，取其上清液，即得乙 酰胆碱酯酶粗提液； (1.5)将步骤（1.4)所得的乙酰胆碱酯酶粗提液的上清液置于表面皿中，进行真空冷 冻干燥，收集后即得乙酰胆碱酯酶制品； (2) 乙酰胆碱酯酶酶活的测定： (2. 1)取0. 02~1.0 mg的乙酰胆碱酯酶制品，用蒸馏水溶解后，得到酶液，在IOmL的比 色管内，加入1~5mL磷酸盐缓冲液，再加入0. 01~0.1 mL酶液混匀，于25~60°C恒温水 浴锅中保温5~60min ; (2. 2)向加入0. 1~1.0 mL碘化硫代乙酰胆碱溶液和0. 1~1.0 mL DTNB溶液后混匀； (2. 3)于400~500nm波长范围内用比色皿比色，记录吸光度，根据吸光度变化值来计 算酶活和比活力，比活力（U/式中：A - 3min时吸光度的变化值； V-反应体系总体积（L); ε -消光系数，1. 36X 104lV(mol Xcm); d一比色皿光程，Icm ; T一反应时间，3min。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于提取乙酰胆碱酯酶的原料采用废弃 器官鸡脑。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述的含TritonX-IOO的磷酸 盐缓冲液中TritonX-IOO浓度为(λ 1%~3. 0% (v/v)，所述比例为1 :2~I :10(g/mL);所 述磷酸盐缓冲液的浓度为0. 02~0. 2M，pH 7. 0~9. 0。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的进行真空冷冻干燥的液体厚度为 0· 1 ~2. Ocm05. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2. 1)中所述的磷酸盐缓冲液pH 6. 0~10. 0,浓度为0. 1M，所用恒温水浴锅温度在25~60°C，保温时间为5~60min。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碘化硫代乙酰胆碱溶液浓度为5~ 30mg/mL〇7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述波长范围在400~500nm。【专利摘要】本专利技术提供。本专利技术是以鸡肉加工中的废弃器官-鸡脑为酶的材料来源，其工艺步骤包括：鸡脑的处理、匀浆液的制备、冷冻离心及粗提液的真空冷冻干燥，即可得到乙酰胆碱酯酶制品。由于传统酶源制得的产品成本高、产量低，而进口酶源价格昂贵，周期较长。本专利技术经酶源的筛选，充分利用了鸡肉加工过程中废弃器官鸡脑，高值化利用，降低了成本，且经优化及检验，酶活较高，粗酶液酶活可达到3.0～5.0U/mL，比活力可达到0.35～0.5U/mg，为后续乙酰胆碱酯酶纯品的制备提供了基础。【IPC分类】C12N9-18【公开号】CN104877975【申请号】CN201510271975【专利技术人】黄惠华, 张佳佳, 黄秋婷 【申请人】华南理工大学【公开日】2015年9月2日【申请日】2015年5月23日本文档来自技高网...
【技术保护点】
利用鸡肉加工过程中的废弃器官‐鸡头提取乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)乙酰胆碱酯酶的制备：(1.1)将洗净烘干的表面皿称重，将新鲜的纵向斩开的鸡头用生理盐水冲洗干净，用镊子将鸡脑取出至于表面皿中，去除非脑组织后再次称重；(1.2)将鸡脑与含TritonX‑100的磷酸盐缓冲液混合，得到混合液；(1.3)将步骤(1.2)所得混合液用匀浆机匀浆1～5min后，静置10～60min，得到匀浆液；(1.4)将匀浆液以3000～10000r/min，0～4℃离心10～30min，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液；(1.5)将步骤(1.4)所得的乙酰胆碱酯酶粗提液的上清液置于表面皿中，进行真空冷冻干燥，收集后即得乙酰胆碱酯酶制品；(2)乙酰胆碱酯酶酶活的测定：(2.1)取0.02～1.0mg的乙酰胆碱酯酶制品，用蒸馏水溶解后，得到酶液，在10mL的比色管内，加入1～5mL磷酸盐缓冲液，再加入0.01～0.1mL酶液混匀，于25～60℃恒温水浴锅中保温5～60min；(2.2)向加入0.1～1.0mL碘化硫代乙酰胆碱溶液和0.1～1.0mL DTNB溶液后混匀；(2.3)于400～500nm波长范围内用比色皿比色，记录吸光度，根据吸光度变化值来计算酶活和比活力,比活力酶活力式中：A—3min时吸光度的变化值；V—反应体系总体积(L)；ε—消光系数，1.36×104L/(mol×cm)；d—比色皿光程，1cm；T—反应时间，3min。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄惠华，张佳佳，黄秋婷，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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