本发明专利技术公开了一种鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测试剂盒，该试剂盒含有三对特异性引物。实验证明，应用本发明专利技术可检测鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒，具有操作简便、敏感性高、特异性强等优点。本发明专利技术用于临床上鉴别和检测鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于PCR检测
，尤其涉及一种鸭甲肝病毒1、3型和番鸭细小病毒 多重PCR检测试剂盒。
技术介绍
鸭甲肝病毒可引起3周龄以内雏鸭肝脏肿大及出血，对雏鸭的致死率高达到90% 以上，是危害养鸭业发展的最为严重的病原之一。鸭甲肝病毒根据其血清型可分为鸭甲肝 病毒1型（DHAV-I)、鸭甲肝病毒2型（DHAV-2)和鸭甲肝病毒3型（DHAV-3)，分别对应传统 的血清I型，台湾新型和韩国新型鸭肝炎病毒。目前，我国流行的鸭甲肝病毒主要为DHAV-I 和DHAV-3。番鸭细小病毒（MDPV)主要侵害3周龄以内雏鸭，感染雏鸭后可以起雏鸭喘气、 腹泻和胰脏坏死和出血，对雏鸭的致死率可达到40%以上也是制约我国番鸭饲养业发展的 最为严重的传染病之一。由于DHAV-I、DHAV-3和MDPV是雏鸭最易感并且致死率非常高的 病毒，而DHAV-I和DHAV-3所导致的鸭病毒性肝炎临床症状和病理变化又非常相似，以致常 常不能及时诊断和有效防控而给养殖业带来巨大经济损失。 目前，对这些病毒传统的检测方法主要有病毒分离、血清学试验、琼脂扩散试验和 酶联免疫吸附试验等，但这些方法存在耗时长、敏感性差、难标准化等局限性，尤其是当这 两种病毒混合感染时，更是增加了临床诊断的难度。 PCR技术实现了对模板的定量检测，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反 应等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重PCR在成本和时间方面就存在一定的劣 势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重PCR采用多 对引物扩增检测多个模板，克服了单重PCR的不足。然而，建立多重PCR方法比单重要复杂 得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同引物间无相互干扰。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种敏感性高、特异性强、操作简便快速的鸭甲 肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测试剂盒。 为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细 小病毒多重PCR检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物1和2 (检测DHAV-1)、引物 3和4 (检测DHAV-3)、引物5和6 (检测MDPV)，它们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 6的碱基序列。 引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为 0· 5-1 : 0· 5-1 : I : I : 1 : 1〇 引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为I : I : I : I : 1 : 1。 上述鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测引物组在PCR扩增方面的 非诊断应用，PCR扩增的退火温度为50. 0°C -60. 1°C。 PCR扩增的退火温度为50. (TC。 鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测试剂盒，包括引物组、PCR缓冲 液和水； 引物组包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6,它们分别 具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 6的碱基序列，其浓度均为25 μ mol/mL，在PCR反应 体系中的终浓度分别为 〇· I U mol /mT5 μ mol/mL、0.1 μ mol/mL-O· 5 μ mol/mL、0. 5 μ mol/ ml,-1.0 μ mol /mT,； PCR 缓冲液为 2 X Taq PCR Mix。 引物1和2、引物3和4、引物5和6在PCR反应体系中的终浓度分别为0. 5 μ mol/ mL、0. 3 μmol/mL、0. 7 μmol/mL。 上述鸭甲肝病毒I型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的 非诊断应用，PCR扩增的退火温度为50. 0°C -60. 1°C。 PCR扩增的退火温度为50. (TC。 针对目前缺乏对鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒进行检测和诊断的有效可 靠的技术，专利技术人结合多重PCR-管多检、高通量、低成本、高效率等优点，研宄设计了三对 特异性引物，据此建立了鉴别和同时检测鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒的多重PCR 检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本专利技术可检测DHAV-1、DHAV-3和 MDPV，并能同时鉴别检测DHAV-I、DHAV-3,具有操作简便、敏感性高、特异性强等优点，既可 以节约时间的成本，又可以减少污染。【附图说明】 图1是多重PCR的特异性试验结果电泳图，图中，M :100bp DNA ladder ;1 : DHAV-lcDNA+DHAV-3cDNA+MDPV cDNA (DHAV-U DHAV-3cDNA 1 μ L, MDPV cDNA 2yL)；2： DHAV-I 的 cDNA ;3 :DHAV-3 的 cDNA ;4:MDPV 的 cDNA ;5 :H5AIV 的 cDNA ;6 :H9AIV 的 cDNA ; 7 :番鸭呼肠孤病毒的cDNA ;8 :鸭圆环病毒DNA ;9 :鸭副粘病毒的cDNA ;10 :鸭肝炎病毒的 cDNA ; 11 :鸭瘟病毒的DNA ; 12 :阴性对照（CldH2O)。 图2是多重PCR的敏感性试验结果电泳图，图中，M :100bp DNA ladder ;1 :52ng/ μ L DHAV-U79ng/μ L DHAV-3,58ng/μ L MDPV cDNA ；2 ：5. 2ng/μ L DHAV-U7. 9ng/μ L DHAV-3、5. 8ng/μ L MDPV cDNA ;3 :520pg/μ L DHAV-l、790pg/μ L DHAV-3、580pg/μ L MDPV cDNA ;4 :52pg/ μ L DHAV-l、79pg/ μ L DHAV-3、58pg/ μ L MDPV cDNA ;5 :5. 2pg/ μ L DHAV-1、 7. 9pg/yL DHAV-3,5. 8pg/μ L MDPV cDNA ；6 ：0. 52pg/μ L DHAV-U0. 79pg/μ L DHAV-3, 0· 58pg/yL MDPV cDNA。 图3是应用本专利技术多重PCR的部分临床样品检测结果电泳图，图中，M为IOObp DNA ladder ;1 为阳性对照（DHAV-1 cDNA+DHAV-3 cDNA+MDPV cDNA) ;2-17 为实验室采集的鸭病 料。【具体实施方式】 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下： 鸭肝炎病毒（DHAV-I)记载在"鸭I型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立"， 中国预防兽医学报，2012,34(2): 112-115,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。 鸭肝炎病毒（DHAV-3)记载在"新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定"，广西畜牧兽 医，2003,19 (5) : 198-199,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。 鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所； 番鸭细小病毒记载在"广西番鸭细小病毒的分离和鉴定"，广西畜牧兽医，2002， 18(6) :本文档来自技高网...
【技术保护点】
鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测引物组，其特征在于包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，赵虹，谢丽基，刘加波，罗思思，谢志勤，邓显文，黄莉，黄娇玲，曾婷婷，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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