本发明专利技术公开了一种重组溶瘤性II型单纯疱疹病毒及其药物组合物，所述病毒的基因组上敲除了两个ICP34.5基因和一个ICP47基因，所述两个ICP34.5基因的位点上分别插入人端粒酶趋化基因SLC-Te-Fc表达盒，所述人端粒酶趋化基因SLC-Te-Fc表达盒依次连接有CMV启动子、次级淋巴组织趋化因子SLC、端粒酶Te(又称TERT)、免疫球蛋白Fc段和牛生长激素多聚腺苷序列BGHpA。溶瘤性HSV不仅有强效的溶瘤作用，还可作为基因载体携带并高效表达肿瘤相关抗原，作为治疗性免疫基因疫苗。二者的联合也克服了溶瘤HSV单独不能强有力地诱导特异性抗肿瘤免疫的弱点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组单纯疱瘆病毒，具体地指一种重组溶瘤性单纯疱瘆病毒II型及 其药物组合物。
技术介绍
单纯疱瘆病毒（Herps simplex virus，HSV)是一种长约154kb的双链DNA病毒， 可在受染宿主细胞核中复制。HSV载体具有以下优点：1)宿主细胞广泛；2)病毒滴度高；3) 外源基因容量大。HSV载体的缺点在于它的毒性。 例如，ICP47蛋白影响与抗原处理相关的转运蛋白（TAPl和TAP2)的功能，阻碍MHC I分子的抗原表呈过程。所以剔除ICP47基因有利于增强免疫反应。另外，剔除ICP47基 因，使下游的USll基因表达增加，USll可对抗PKR对病毒生长繁殖的抑制。ICP34. 5为神 经毒因子，缺失了 ICP34. 5的病毒能选择性地杀伤肿瘤细胞，其机理为：ICP34. 5能对抗PKR 对翻译起始因子elf-2a的灭活，使病毒顺利繁殖。因此，失去了 ICP34. 5的病毒进入正常 细胞后，诱导干扰素/PKR通路活化，进而导致elf_2a失活，病毒蛋白不能合成、病毒繁殖受 阻。而大多数肿瘤细胞的干扰素/PKR信号通路受损。因此，失去了 ICP34. 5的病毒可以在 肿瘤细胞内生长繁殖。以及ICP6基因编码核糖核苷酸还原酶，该酶为病毒DNA复制提供必 需的前体，在分裂细胞（如肿瘤细胞）中为非必需基因，剔除该基因可以增加病毒载体的载 量。 众所周知，DNA核酸疫苗如CADV的缺点是体内转染效率低，但如用体内转染效率 高的病毒载体携带CADV，就可客服CADV这一缺点。溶瘤性HSV不仅有强效的溶瘤作用，还 可作为基因载体携带并高效表达肿瘤相关抗原，作为治疗性免疫基因疫苗。二者的联合也 克服了溶瘤HSV单独不能强有力地诱导特异性抗肿瘤免疫的弱点。 2010年，申请号为2010101162753的中国专利技术专利公开了一种重组II型单纯疱瘆 病毒载体及其制备方法、重组病毒、药物组合物及应用，专利技术人刘滨磊剔除了野生II型单 纯疱瘆病毒HG52株的基因组上的ICP34. 5基因和ICP47基因，并在剔除了 ICP34. 5基因的 位点上插入人粒-巨噬细胞集落刺激因子表达盒。其重组病毒具有安全性好、溶癌活性高、 抗肿瘤的免疫反应强的特点。 OHSV2-GM-CSF表达的GM-CSF虽然能促进DC的成熟，但病毒溶瘤释放的肿瘤相关 抗原（如端粒酶抗原）并不一定能有效地被DC细胞捕获并递呈。而 〇HSV2-SLC-Te-Fc则 解决了这一问题。SLC-Te-Fc融合蛋白上有肿瘤广谱抗原端粒酶（Te，又称TERT)的序列。 其SLC趋化吸引免疫细胞（DC、T淋巴细胞等）到肿瘤部位，Fc则可与DC上相应受体结合， 使DC能高效捕获Te抗原并递呈给T细胞，从而更有效地激活特异性抗肿瘤免疫反应。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题就是提供一种重组溶瘤性II型单纯疱瘆病毒及其药 物组合物。该重组溶瘤性II型单纯疱瘆病毒，也克服了溶瘤HSV单独不能强有力地诱导特 异性抗肿瘤免疫的弱点。 为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种重组溶瘤性II型单纯疱瘆病毒，所述病 毒的基因组上敲除了两个ICP34. 5基因和一个ICP47基因，所述两个ICP34. 5基因的位点 上分别插入人端粒酶趋化基因 SLC-Te-Fc表达盒，所述人端粒酶趋化基因 SLC-Te-Fc表达 盒依次连接有CMV启动子、次级淋巴组织趋化因子SLC、端粒酶Te (又称TERT)、免疫球蛋白 Fc段和牛生长激素多聚腺苷序列BGHpA。该病毒分类命名为II型单纯疱瘆病毒，Herpes SimplexVirus Type2并于2014年1月3日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏地点：北京。其保藏编号为CGMCC No. 8709。 本专利技术还提供了一种重组溶瘤性II型单纯疱瘆病毒的制备方法，包括以下步骤： (1)从野生型II型单纯疱瘆病毒HG52株中剔除ICP47基因，构建HG52dICP47重 组II型单纯疱瘆病毒： a.提取II型单纯疱瘆病毒HG52株的基因组DNA ; b.构建含有ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pdICP47H2 : bl.使用如下所示的扩增ICP47基因上游侧翼区序列和扩增ICP47基因下游侧翼 区序列的引物，以步骤a得到的基因组DNA为模板，PCR扩增ICP47基因上游侧翼区序列和 下游侧翼区序列； 扩增 ICP47 基因正向引物 146554Agagtcacgacgcatttgccc 146574 上游侧翼区序列反向引物 14m5ATACGATCTCGTCGACCGGGG 147755 扩增 ICP47 基因正向引物 148°33CATGGTGTCCCGTCCACGAAG 148。53 下游侧翼区序列反向引物 149211ggttcgtggtaatgagatgcc 149191 b2.将步骤bl扩增所得PCR产物上游侧翼区序列插入到PSP73质粒的SmaI位点， 得到 PSP73ICP47US 质粒； b3.将步骤bl扩增所得PCR产物下游侧翼区序列插入到pSP73质粒的SmaI位点， 得到PICP47DS质粒； b4.用限制性内切酶SacI和BamHI从步骤b3获得的pICP47DS质粒中酶切出下游 侧翼区序列，并将该下游侧翼区序列插入到步骤b2获得的pSP73ICP47US质粒的BglII位 点，得到含ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的pdICP47H2质粒， b5.将巨细胞病毒IE启动子控制的绿色荧光蛋白表达盒插入到步骤b4获得的 pdICP47H2 质粒的 EcoRV 位点，得到 pdICP47H2-GFP 质粒； c.构建剔除ICP47基因的重组II型单纯疱瘆病毒HG52dICP47 : cl.将步骤a得到的全长病毒DNA与步骤b得到的pdICP47H2-GFP质粒共转染BHK 细胞，全长病毒DNA上的ICP47基因与pdICP47H2-GFP质粒上的绿色荧光蛋白表达盒发生 同源重组，发生重组病毒的毒斑发绿色荧光； c2.挑选绿色荧光毒斑，纯化出重组II型单纯疱瘆病毒HG52dICP47-GFP ; c3.提取重组II型单纯疱瘆病毒HG52dICP47-GFP的基因组DNA ; c4.将步骤c3得到的重组II型单纯疱瘆病毒HG52dICP47-GFP的全长病毒DNA与 步骤b4获得的pdICP47H2质粒共转染BHK细胞，重组II型单纯疱瘆病毒HG52dICP47-GFP 上的绿色荧光蛋白表达盒发生同源重组被剔除； c5.挑选无荧光毒斑，纯化出重组II型单纯疱瘆病毒HG52dICP47 ; (2)剔除ICP34. 5基因，构建重组II型单纯疱瘆病毒HG52dICP47d34. 5-GFP : A.提取重组II型单纯疱瘆病毒HG52dICP47的基因组DNA ; B.构建含有ICP34. 5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pH2dI34. 5 : BI.使用如下所示的扩增ICP34. 5基因上游侧翼区序列和扩增ICP34. 5基因下游 侧翼区序列的引物，以步骤a得到的基因组DNA为模板，PCR扩增ICP34. 5基因上游侧翼区 序列和下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组溶瘤性II型单纯疱疹病毒，所述病毒的基因组上敲除了两个ICP34.5基因和一个ICP47基因，其特征在于：所述两个ICP34.5基因的位点上分别插入人端粒酶趋化基因SLC‑Te‑Fc表达盒，所述人端粒酶趋化基因SLC‑Te‑Fc表达盒依次连接有CMV启动子、次级淋巴组织趋化因子SLC、端粒酶Te、抗体Fc段和牛生长激素多聚腺苷序列BGHpA，其保藏编号为CGMCC No.8709。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘滨磊，张叔人，张文，葛科立，吴基良，黄胜堂，张友会，
申请(专利权)人：刘滨磊，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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