本发明专利技术属于分子药物学和分子医学领域，涉及一种自身互补型重组腺相关病毒载体和内源性血管生成抑制因子基因药物的制备及应用，具体涉及自身互补型重组腺相关病毒scrAAV8载体和内源性的血管生成抑制因子KAL的基因药物，实验研究结果表明，该药物可以靶向有效地抑制肝癌的增殖、转移，可作为临床应用的安全有效、靶向性更强的治疗肝癌的基因药物。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术属于分子药物学和分子医学领域，涉及一种自身互补型重组腺相关病毒载 体和内源性血管生成抑制因子基因药物的制备及应用。 技术背景： 原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC)简称肝癌，是一种高发病率和 高死亡率的恶性肿瘤疾病，被冠以"癌中王"。根据2014年2月3日世界卫生组织（WHO)表 数据统计，2012年中国新增患者约占全球新增肝癌病例的一半，相应的死亡率约占世界范 围内的51%。被批准上市用于晚期肝癌临床治疗的分子靶向药物索拉非尼，作为化学药物 显示出巨大的潜力，使晚期肝癌的治疗困境得到明显改善。但是肝癌的发生是多因素多基 因多途径交叉对话复杂通路调控的，具体机制目前仍不明确，针对某个单一靶点或信号通 路治疗往往难以遏制肿瘤进展。无论是合成的西药、还是我国的传统中药，普遍存在短期有 效、多次用药、见效缓慢、靶向性差和靶点单一的缺点。因此，寻求通过多靶点、多途径的抗 肿瘤药物是当前研宄的热点。基因治疗的出现给肝癌的治疗带来了希望，也给这类疾病的 临床治疗提供了新思路。 rAAV载体系由细小病毒家族的腺相关病毒改造而来，载体因其基因结构简单、理 化性质稳定、宿主范围广、在体内外长期高效表达、免疫原性及遗传毒性低以及可规模化生 产等优点，已成为目前基因治疗领域中非常有前景的基因病毒载体。截止2015年1月，进 入临床申报的基因治疗有2206项，rAAV应用于临床试验的研宄有127项，占所有载体的 5. 9% (http://www. abedia. com/wiley/) 〇 2012年，欧盟最终批准了首个可以上市的基因 治疗药物Glybera，用于治疗一种极其罕见的遗传性疾病一一脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD)， 成为基因治疗领域的重大推动力。此外，与研宄较深入的单链AAV2相比，AAV8具有免疫原 性低、肝脏革E向性强的优势，自身互补型AAV(self-complementary AAV，scAAV)是一种自身 互补型腺相关病毒载体，其基因组本身以双链形式存在，与常规的单链AAV (ssAAV)载体相 比，具有高效快速表达的特点，可以显著降低在治疗过程中其载体本身所诱发的免疫反应。 因而scrAAVS被认为是肝脏相关疾病基因治疗最具前景的载体。 Kallistatin(KAL)，一种内源性的血管生成抑制因子，不仅能抑制血管生成、血管 舒张，还具有显著的抗氧化、抗炎症及抗肿瘤的多重功效。研宄表明，ssrAAV2-KAL可显著抑 制肝癌的增殖，但由美国宾州大学主持进行的治疗血友病的ssrAAV2基因药物I/II期临床 研宄却发生了严重的细胞免疫反应。本研宄选取易于定量检测的分泌型萤光素酶（Gaussia luciferase，Gluc)作为报告基因，以scrAAV2载体作比较，探讨scrAAV2/8_KAL在体内外对 肝癌的治疗作用，以寻求一种更安全有效、靶向性更强的治疗肝癌的基因药物应用于临床。 该项研宄成果，迄今尚未见有相关报道。
技术实现思路
： 本专利技术提供了一种靶向治疗肝癌的基因药物（scrAAV8-KAL)。 本专利技术提供了 scrAAV8-KAL的制备方法。 本专利技术提供了基因治疗药物scrAAV8_KAL在制备抗肝癌药物的应用。 本专利技术提供了以所述基因治疗药物scrAAV8-KAL为有效成分与药学上可接受的 一种或多种载体组成的药物组合物。 本专利技术提供了所述组合物在制备抗肝癌药物中的应用。 本专利技术主要包括以下步骤： (1)载体质粒是血清型AAV2的r印基因，AAV8的cap基因。治疗基因选择内源性 的血管生成抑制因子Kallistatin(KAL)，基因表达框选择CB作为启动子，土拨鼠肝炎转录 后基因表达调控元件是WPRE。 (2)三质粒磷酸钙转染法制备scrAAV2/2-Gluc、scrAAV2/8-Gluc作为参比，底物 腔肠素（coelenterazine)检测Gluc体外转导效率，同时生产基因药物ssrAAV2/8_KAL、 scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL、scrAAV2/9-KAL ; (3)采用MTT法检测基因药物scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL对细胞增殖的影响， PI、Dye eFluor670(Ki-67)流式细胞仪检测基因药物对细胞周期、增殖的影响； (4)划痕法、Western Blot和小管形成实验检测结果显不，scrAAV2/8组可以明显 抑制SMMC-7721迀移、上皮间质转化，抑制HUVEC小管形成能力； (5)不同免疫背景小鼠（Balb/c、C57BL/6)体内以不同血清型scrAAV-KAL给药，不 同时间点小鼠尾静脉采血，Elisa检测血清、组织中KAL表达量，36周后血清和肝脏中KAL 依然高表达； (6)本专利技术所述肝癌治疗用基因药物scrAAV2/8-KAL高低剂量，rAAV适用于腹腔 注射、静脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、口服等途径给药。scrAAV2/8尾静脉注射组 的血清以及肝脏内KAL表达量最高，而且呈剂量依赖性。 (7) Balb/c 小鼠体内尾静脉注射 ssrAAV2/8-KAL、scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL， 2周、6周、12周检测组织中KAL的mRNA、蛋白水平表达量，为进一步的人体药代动力学研宄 提供数据。 (8)体内药效学实验，建立H印G2肝癌皮下移植瘤模型，采用瘤内注射形式进行给 药，每隔三天观察记录肿瘤大小。7周后通过肿瘤体积，重量以及组织中KAL蛋白分布情况， 评价scrAAV2/8-KAL的抗肿瘤效果。肿瘤组织免疫组化染色结果表明，基因药物对!fepG2 的增殖侵袭具有抑制作用，scrAAV2/8-KAL作用大于scrAAV2/2-KAL。【附图说明】： 图I :ssrAAV和scrAAV载体介导的病毒基因组的元件组成 其中：CAG-ssrAAV ;CB-scrAAV. 图2 :不同血清型scrAAV-Gluc在HUVEC、不同肝（癌）细胞内转导效率 其中：2DG-scrAAV2/2-Gluc 组；8DG-scrAAV2/8-Gluc. 图3 : scrAAV-KAL选择性杀伤不同细胞 图 4 :scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL 抑制细胞增殖 其中：DYE染色组：绿色一正常组；红色一scrAAV2/2-KAL组；蓝 色一scrAAV2/8-KAL ;黄色一scrAAV2/9-KAL. Ki-67 组：蓝色一正常组；红色一scrAAV2/2-KAL 组；绿色一scrAAV2/8-KAL ;黄 色一scrAAV2/9-KAL. 图 5 :scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL 对细胞周期阻滞作用 图6 :scrAAV-KAL抑制SMMC-7721肝癌细胞的迀移 图7 :scrAAV-KAL抑制SMMC-7721肝癌细胞上皮间质转化 图8 :rAAV-KAL抑制HUVEC细胞的小管形成 其中：a-正常组；b--ssrAAV2/8-KAL 组；c--scrAAV2/2-KAL 组； d-scrAAV2/8-KAL 组；e-scrAAV2/9-KAL. 图9 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向肝癌的基因治疗药物，其特征是，所述药物是由载体质粒及治疗基因药物scrAAV‑KAL构成，其中载体质粒是优选自血清型AAV2自身互补型的重组腺相关病毒scrAAV，治疗基因药物选自内源性的血管生成抑制因子KAL。基因表达框依次是：CB启动子，KAL cDNA，polyA，土拨鼠肝炎转录后基因表达调控元件WPRE，表达框的一端为ITR。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许瑞安，高燕，崔秀灵，
申请(专利权)人：许瑞安，
类型：发明
国别省市：福建;35
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