一种借助干细胞壁龛培养干细胞的方法技术

本发明专利技术公开一种干细胞壁龛及其制备方法与应用，属于组织工程领域。该干细胞壁龛的制备方法包括以下步骤：周围支持细胞转染自杀基因；将转染自杀基因的周围支持细胞和凝胶混悬接种在培养容器中；在诱导因素的作用下促进周围支持细胞分泌细胞外基质；待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除周围支持细胞，得到特异性的干细胞壁龛。本发明专利技术获得的干细胞壁龛可以维持干细胞良好的干性，不存在免疫排斥反应，具有良好的生物相容性和降解性，且降解产物对人体无害。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于组织工程领域，具体地说是涉及。
技术介绍
干细胞移植技术是通过对特定的干细胞进行筛选、增殖，再通过一定的方式移植到病变位置进行细胞治疗的方法。与器官移植相比存在的优势:①由于干细胞移植技术是利用体外培养的方式使细胞扩增到想要的数量，因此不存在数量不足的限制；②来源于自体的细胞移植后不存在免疫排斥反应，避免了术后长期使用免疫抑制药物。因此，干细胞移植技术临床应用前景巨大。目前，干细胞治疗方式包括:血管内注射，组织内注射，细胞片法。主要以两种形式进行干细胞移植，一是以细胞悬浮液的状态移植，这种方法是直接注射一定量的干细胞悬液，但血液的循环和病变部位的炎症环境严重制约着到达病变部位的细胞数量及细胞的存活率，造成细胞的浪费。另一种是以干细胞片的形式植入体内。干细胞片能够比较好的解决掉细胞浪费的问题。然而，在利用干细胞片移植过程中需要用到干细胞的支持材料，不同的材料对干细胞的生物学功能有不同的作用。目前针对干细胞片移植技术中采用的生物材料主要包括以下研宄:1.合成高分子生物材料，在普通的高分子材料中添加具有细胞亲和性的物质，例如胶原和明胶等，并进一步对其进行生物改性，使其满足细胞的生长条件，达到生物材料的基本要求。这种材料的优点是①干细胞在上面能够生长和增殖，保证了细胞在移植前的活力；②大部分用于干细胞治疗过程中的合成高分子材料都能够降解，减少了材料作为异物在体内存在的时间。但合成高分子材料还存在着一些缺点:材料降解后的产物是否对机体有影响还待进一步的实验证明，对于一些难培养的干细胞，是否能够很好的保持移植前干细胞的干性还需进一步的研宄。2.利用温敏材料制备无载体细胞片。利用温敏材料制备无载体细胞片为细胞治疗提供了一个很好的方向，但应用在干细胞治疗中还是存在一定的问题。在温敏材料上培养干细胞，并不能保证干细胞的干性，例如利用温敏法培养骨髓间充质干细胞，在移植前已经分化，并不能达到干细胞治疗的效果。3.天然基质材料。目前常用的天然材料主要包括脱细胞基质材料和天然生物膜材料。与合成高分子材料相比，天然基质材料有很大的优势:成分更接近细胞周围的环境，细胞毒性更小，组织相容性更好。但目前存在的脱细胞基质在进行脱细胞处理时使得天然基质中丢失了很多成分，破坏了细胞外基质天然的结构，在进行干细胞培养过程中不能保证干细胞的微环境。目前还未出现一种细胞支架适用于各种类干细胞使得干细胞维持干性，保持未分化状态，这就给干细胞的移植带来很多的不便。寻找一种适用于各类干细胞移植的细胞支架是目前干细胞移植技术发展的关键。作为转运干细胞的载体要能够充分模拟干细胞体内生长的微环境，保证干细胞的干性。干细胞壁龛与干细胞的生物学功能有着密切的关系。干细胞壁龛包含了干细胞周围的一切微环境(细胞外基质、细胞与细胞之间的信息交流、粘附因子等)。干细胞壁龛能使干细胞处于GO期，对干细胞起到保护作用，使干细胞与周围的分化因子分离，保持干细胞的干性。研宄表明干细胞壁龛通过其不对称的结构调节干细胞的分裂增殖、分化及凋亡情况。其中细胞外基质在干细胞壁龛中发挥着重要作用。细胞外基质不仅仅对细胞的静态性质(支持、保护、连接、抗压等物理学作用)产生影响，而且在细胞的动态生长过程中产生重要的作用:1.影响细胞的存活、增殖与死亡。在正常的真核细胞中，大多数细胞必须粘附与特定的细胞外基质上才能维持细胞活性，并且不同的细胞增殖所需的细胞外基质不同。例如，上皮细胞一旦脱离细胞外基质便会凋亡，且其在层粘连蛋白上增殖加快，在纤粘连蛋白上增殖减慢；而纤粘连蛋白和层粘连蛋白对成纤维细胞增殖的影响与上皮细胞相反；2.决定细胞的形状。研宄表明，不同的细胞分泌的细胞外基质成分组成不尽相同，导致介导的细胞骨架也不相同，从而使细胞在不同的细胞外基质上变现出不同的形状。例如，上皮细胞粘附于基膜上时可表现出极性，脱离基膜时多呈现球形；3.控制细胞的分化。细胞外基质中的粘附分子和整合素共同调控着干细胞对细胞外基质的粘附，进而控制干细胞的分化:在皮肤中，整合素β-1与基质中糖蛋白结合调节干细胞分化。细胞外基质中还存在着许多细胞因子，共同影响着干细胞的分化状态:在神经系统中，丝裂原样生长因子与神经干细胞的增殖和分化都有重要的作用。研宄表明，由同一干细胞分裂得到的两个干细胞，两者接触的细胞外基质不同导致分化程度、分化结果不同；4.参与细胞的迀移。胞外、胞内信号分子在调节细胞骨架动力装置时会产生驱动力，肌动蛋白细胞骨架介导黏附时会产生锚定力，驱动力和锚定力之间的相互协调决定了细胞的迀移速度和方向。脑内整合素与细胞外基质蛋白Reelin相互作用促进神经细胞的迀移。以上说明细胞外基质作为干细胞壁龛的组成确实对干细胞的生物学功能有着很大的作用。是否可利用制备的干细胞壁龛作为转运干细胞的特异性支架？干细胞干性的维持的具体机制目前还不明确，但现有研宄证明干细胞的干性的维持与干细胞壁龛有着重要关系。干细胞壁龛包含了干细胞周围的一切环境，利用干细胞周围支持细胞分泌的细胞外基质制备三维支架，可以最大程度地模拟干细胞的微环境，很好地保证干细胞的特异性微环境，满足干细胞的生长条件，维持细胞干性。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种干细胞壁龛的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的干细胞壁龛。本专利技术的再一目的在于提供上述干细胞壁龛的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种干细胞壁龛的制备方法，包含以下步骤:(I)周围支持细胞转染自杀基因；(2)将转染自杀基因的周围支持细胞和凝胶混悬接种在培养容器中；(3)在诱导因素的作用下促进周围支持细胞分泌细胞外基质；(4)待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除周围支持细胞，得到特异性的干细胞壁龛。所述的周围支持细胞是指存在于干细胞周围，可以分泌细胞外基质，对干细胞起到支持和保护及信息交流，维持干细胞生物学功能的细胞；所述的转染的方法优选为病毒或非病毒的转染方法；所述的病毒转染方法优选为利用逆转录病毒载体，腺病毒载体，单纯疱瘆病毒载体，EB病毒载体，细小病毒载体和痘病毒载体介导的转染方法中一种或一种以上；所述的非病毒转染方法优选为阳离子聚合物转染法，磷酸钙共沉淀转染法，人工脂质体法，DEAE(二乙氨乙基)葡聚糖介导转染法，直接注射法，电穿孔法，激光辐射法，磁性微粒法和基因枪法中的一种或一种以上；所述的自杀基因优选为胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、大肠杆菌谷氨酸丙酮酸转氨酶基因、细胞色素P450基因、硝基还原酶基因、羧肽酶基因、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸酶基因、白喉毒素基因和FAS基因中的一种或一种以上；所述的凝胶优选为纳米多肽凝胶、纤维蛋白胶、基质胶、胶原胶和天然生物凝胶中的至少一种；所述的诱导因素优选包含物理因素、化学因素，也包括预先对周围支持细胞转染控制细胞外基质表达的基因中的一种或一种以上；所述的物理因素优选包括剪切力、压力、高糖环境的一种或一种以上；所述的化学因素优选包括维生素C、转化生长因子β (TGFβ)、血小板衍生生长因子(TOGF)、表皮生长因子(ECG)、胰岛素样生长因子(IGFl)、白介素I (IL-1)、IL-4、IL-6、IL-8、促有丝分裂蛋白激酶、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞壁龛的制备方法，其特征在于包含以下步骤：(1)周围支持细胞转染自杀基因；(2)将转染自杀基因的周围支持细胞和凝胶混悬接种在培养容器中；(3)在诱导因素的作用下促进周围支持细胞分泌细胞外基质；(4)待周围支持细胞分泌的细胞外基质相互连接形成三维支架后，启动自杀基因，去除周围支持细胞，得到特异性的干细胞壁龛。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：武征，林熙，王颖薇，周清，张建华，樊泽培，张中夏，秦子夕，严惠泽，路程，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44