生物探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了生物探针，其特征在于包含末端连接两个不同寡核苷酸区的单链核苷酸区其中寡核苷酸区中至少一个包含具有特征性检测特性的可检测元件且其中可检测元件被布置在寡核苷酸区上以致可检测特性的可检测性低于当相同数量的可检测元件结合到相应数量的单个核苷酸时。该生物探针尤其可用于捕获单个核苷酸或单链核苷酸以产生可由限制酶和外切核酸酶降解的占用探针从而产生携带可检测形式的可检测元件的单个核苷酸。典型地可检测元件是荧光团且通过如使用多个相邻的荧光团或荧光团和与其连接的猝灭剂的混合物使探针中相应的特征性荧光不可检测。优选地单链核苷酸区由单个核苷酸组成，其关联的核苷酸碱基是DNA或RNA中发现的特征性核苷酸碱基之一。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物探针及其应用本专利技术涉及可用于检测含有多核苷酸的靶标分子中互补性单核苷酸或核苷酸序列的存在的生物探针。在分析分子生物学中广泛应用典型地包含长度少于1000个核苷酸的已知序列顺序的单链寡核苷酸的生物探针。当在探针与靶标的核苷酸碱基之间存在完全的或基本上完全的序列互补性时，所述探针典型地通过将其连接到靶标(例如，来源于天然存在的病原体的DNA的靶标)来起作用。典型地，所述探针的核苷酸标记有可检测元件，如放射性或荧光标记物，以使当所述探针用于处理分析物溶液或底物(据信其中或其上已经捕获了靶标)时，通过寻找并检测所述检测元件的特征性检测特性来揭示所述靶标的存在与否。一类这样的探针由本领域中被称为‘分子指示标(molecularbeacons)’的物质所代表；例如，如在WO02/06531或US8211644中所述。这些探针由单链寡核苷酸组成，所述单链寡核苷酸实际上回折于其自身上从而产生充当探针的传感器的残余的单链环和短的茎，在所述茎中，邻近两个末端的核苷酸通过互补核苷酸碱基配对彼此结合；由此产生双链的区域。这种布置是高度紧张的，所述布置可以连接到发夹，在所述发夹中，单链环连接到名义上的双链寡核苷酸(即，所述茎)的同一末端的互补链。所述寡核苷酸的游离的3’和5’端(现在彼此邻近并且在茎的远端)分别连接荧光团和猝灭剂。其彼此接近确保了不产生显著的荧光。使用时，靶标与单链环结合，产生额外的应变，所述应变然后使得所述茎解链，由此使所述荧光团和猝灭剂远离，并且允许前者发出荧光。这些探针的一个缺点是所述环需要相对长，例如，20-30个核苷酸，这使得其不适合检测较小的靶标，并且尤其是不适合检测包含单个核苷酸的那些靶标。US2006/063193描述了一种检测方法，所述方法包括使未知的单链分析物与各自具有不同序列的不同探针类型的阵列接触；使所述分析物与其互补探针杂交，并且通过对杂交的探针进行质谱法确定序列。然而，与本专利技术的方法不同的这种方法尤其不适于鉴定单个核苷酸或小的寡核苷酸片段。EP1662006教导了DNA探针，所述DNA探针来源于两种不同长度的互补寡核苷酸链，其中较长的那个被设计为单链靶标的序列互补物。在其未使用的状态，所述探针由此包含双链区和单链区，所述单链区可以识别靶标并且通过杂交与靶标部分连接。然后，探针中的两条链中较短的那个和靶标序列的其余部分可以交换，这能够允许所述分析物与所述探针完全杂交。在一个实施方案中，探针的两条链上相应的核苷酸用成对的荧光团和猝灭剂功能化，使得未使用的探针不发出荧光。然而，当较短的链被靶标的其余部分交换掉时，所述荧光团被释放出来发出荧光。WO2006/071776描述了一种基于连接的RNA扩增方法，其包括使用包含双链区和单链3’端区域的核酸。在这种方法中，RNA的5’端连接到单链区，并且3’端连接到双链区的5’链。然后，可以利用已知的技术扩增RNA。然而，所述核酸没有表现为标记有可检测元件。WO2009/120372教导了一种方法，其中未知序列的双链寡核苷酸先通过首先将第一和第二发夹单链区与其末端连接而转化成模板核酸。然后，这样产生的模板可以用于利用涉及引发发夹的常规聚合酶介导的测序方法在正义和反义方向上同时对双链寡核苷酸进行测序；分离双链寡核苷酸的组成链：并且沿着所分离的链延伸引物。然而，模板中的核苷酸似乎无一被可检测元件标记。现在我们开发了替代的生物探针，其中可检测元件基本上是不可检测的，除非将其通过一系列生化/酶反应特异性激活，所述反应从所述探针释放一个或一级联的处于更容易检测状态的可检测元件。这样的生物探针可用于靶标浓度非常低的情形，并且尤其可用于这样的情形，其中靶标包含一串单核苷酸，其关联的核苷酸碱基顺序对应于需要确定序列的未知生物分子的顺序。这使得可能在高通量DNA测序装置中使用本专利技术的探针。因此，根据本专利技术，在本专利技术的第一方面提供一种生物探针，其特征在于，其包含单链核苷酸区，所述单链核苷酸区的末端分别连接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被这样布置在所述寡核苷酸区上以致所述可检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单个核苷酸时低。在一个优选的实施方案中，所述可检测元件包含荧光团，并且所述探针本身在用于检测所述荧光团的那些波长基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可能在电磁谱的大部分表现出普遍的、低水平的背景荧光，但是典型地将存在一个或少量的特定波长或波长范围(wavelengthenvelopes)其中荧光的强度处于最大值。在特征性检测所述荧光团的这些最大值中的一个或多个，基本上不应当产生荧光。在本专利技术的情形中，术语‘基本上不发荧光’或等价的词语意指与探针相连的全部荧光团在相关特征波长或波长范围的荧光强度不到等量的游离荧光团的相应的荧光强度的25％；优选不到10％；更优选不到1％，并且最优选不到0.1％。原则上，可以使用任何方法确保在探针的未使用状态，所述荧光团发出的荧光不如当其各自结合到其本身的单个核苷酸上时。一种方法是另外地将猝灭剂与其紧邻地相连。另一种方法是基于这样的观察：当多个荧光团彼此紧邻地连接到同一个探针上时，它们倾向于彼此充分猝灭，使得可以在不需要猝灭剂的条件下实现前段所述的标准。在本专利的这种情形中，构成荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的‘紧邻’的因素取决于所用的特定的荧光团和猝灭剂，并且可能取决于寡核苷酸区的结构特征。由此，意欲根据所需的结果解释该术语，而不将其解释为在探针上的任何特定的结构布置。然而，并且为了提供示例的目的，要指出的是，当邻近的荧光团或邻近的荧光团与猝灭剂相隔以一段距离，并且所述距离对应于其特征性距离(典型地小于5nm)时，将获得充分的猝灭。优选地，包含探针的寡核苷酸区中的至少一个用多至20个、优选多至10个、并且最优选多至5个荧光团标记。为了获得的最大的优点，优选的是，至少一个寡核苷酸区用至少2个、优选至少3个荧光团标记。因此，本文特别预期由这些最大值与最小值的任意置换构建的范围。如果使用猝灭剂，类似地，优选的是，所述探针用多至20个、优选多至10个、并且最优选多至5个猝灭剂标记。尽管预期可以将超过一种类型的荧光团与探针连接，以便例如给予其特征性指纹，但是，优选的是，与给定探针连接的所有探针都是相同类型的。优选地，所述荧光团和猝灭剂在所述寡核苷酸区的不同链上或者彼此相对(在其通过折叠单链寡核苷酸前体产生的情况下)。关于荧光团本身，它们原则上可以选自任意本领域中常规使用的那些，包括但不限于呫吨部分，例如，荧光素，罗丹明及其衍生物，如荧光素异硫氰酸酯，罗丹明B等；香豆素部分(例如，羟基-、甲基-和氨基香豆素)和青色素部分如Cy2，Cy3，Cy5和Cy7。具体的实例包括来源于下述常用染料的荧光团：Alexa染料，花青染料，AttoTec染料，和罗丹明染料。实例还包括：Atto633(ATTO-TECGmbH)，TexasRed，Atto740(ATTO-TECGmbH)，RoseBengal，AlexaFluorTM750C5-马来酰亚胺(Invitrogen)，AlexaFluorTM532C2-马来酰亚胺(Invitrogen)本文档来自技高网...

【技术保护点】
生物探针，其特征在于，其包含单链核苷酸区，所述单链核苷酸区的末端连接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被这样布置在所述寡核苷酸区上以致所述检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单个核苷酸时低。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.10.04 GB 1217770.51.检测单核苷酸靶标的方法，其特征在于，其包含下述步骤：(1)使用聚合酶和连接酶将所述靶标连接到探针，所述探针包含捕获位点，所述捕获位点由与所述靶标互补的单核苷酸组成，所述单核苷酸的末端连接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被布置在所述寡核苷酸区上以致所述检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单个核苷酸时低，从而产生完全是双链的占用的探针，和(2)用限制酶和外切核酸酶处理所述占用的探针，从而释放能够被检测的形式的可检测元件。2.权利要求1所述的方法，其特征在于，其还包括观察由所述释放的可检测元件表现出来的可检测特性。3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡梅伦·亚历山大·弗雷林，巴纳比·巴姆福思，布鲁诺·弗拉维奥·诺盖拉·德·索萨·苏亚雷斯，托马斯·亨利·艾萨克，鲍里斯·布赖纳，亚历山德拉·纳塔莱，米歇尔·阿马西奥，
申请(专利权)人：贝斯四创新公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB