一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法。本发明专利技术构建了包含EGFP和RFP不同荧光蛋白报告基因的HPV假病毒，建立了包含不同报告基因假病毒混合检测不同中和抗体的检测方法。该方法操作简便、检测周期短(72小时)、灵敏度高、可重复性好、结果判读客观、高通量、样品需求量少、检测成本低、方法可标准化，便于实验室间推广、可同时检测针对多种型别病毒的中和抗体，更接近疫苗免疫后的真实状况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及生物
，特别设及一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方 法。
技术介绍
人乳头瘤病毒（HPV)属于乳头瘤病毒科（papillomaviridae)，为无包膜的双链环 状DNA病毒，现在经过完全测序后归类的HPV可分为100多个基因型。根据其致癌性可分 为"低危"型和"高危"型。前者包括HPV6、HPV11等，主要引起良性的生殖器扼和低度的宫 颈上皮坏死（CIN);后者包括HPV16、HPV18等，它们的感染是引发宫颈癌的主要原因。在大 多数情况下，免疫系统能在HPV造成伤害之前将其清除，95%W上的生殖道感染能在3到5 年内痊愈。但也有少数HPV感染不能被清除，经过多年的一系列的病变发展为宫颈癌。宫颈 癌是危害女性健康的第二大恶性肿瘤，95%W上的宫颈癌病理组织中能够检测到HPVDNA， 超过15个HPV型与宫颈癌的发病有关，因而宫颈癌成为第一个由世界卫生组织（WHO)确认 的完全由病毒感染所引起的癌症。全球每年发病50万例，主要发生于发展中国家，我国每 年新发病例约13. 5万，约占世界宫颈癌新发病例总数的1/4,死亡人数约为5万人。开发、 研制HPV预防性疫苗被认为是预防HPV感染及宫颈癌的最根本手段。而预防性疫苗成功与 否的关键是其能否诱导有效的的体液免疫，只有产生高滴度针对HPV的中和抗体才能抵抗 外来HPV的感染。因此建立稳定、有效的疫苗评价系统，检测疫苗免疫反应的保护效果，对 于疫苗的研制和质控具有重要意义。[000引但由于HPV的生命周期与细胞的分化状态密切相关，无法在体外通过传统的细胞 培养系统进行生长繁殖，且从被感染的病理组织中提取的病毒量太少，不能满足中和试验 的需要。Buck等利用乳头瘤病毒（PV)能非特异包装DNA的特性，将含密码子优化的PV晚 期蛋白L1、L2基因的质粒与表达GFP的报告质粒共转染，48小时后收取细胞裂解液，成功产 生了高滴度的假病毒，该种假病毒与天然病毒结构和抗原表位类似，可体外模拟HPV感染， 对于HPV的生物学研究、抗体中和活性的鉴定和疫苗开发都有重要意义。Pastrana等用优 化的基因共转染产生了包裹分泌性碱性磯酸酶（SEA巧报告基因的假病毒，并在此基础上 建立了基于SEAP的检测HPV中和抗体的方法。 直接化ISA法是检测抗体最常用的方法，该方法首先将主要衣壳蛋白L1形成的病 毒样颗粒（VL巧做适当稀释后包被化ISA板，封闭后加入倍比稀释的待测血清，再加入酶标 的二抗，底物显色，通过酶标仪读取每孔光密度值，判断血清中的中和抗体滴度。该方法的 缺点是：直接ELISA只能初步测定总抗体滴度，而非中和抗体滴度。葛兰素史克（GSK)公司 HPV疫苗临床试验免疫学检测所用的是该方法，所用的包被抗原是GSK公司生产的抗原，与 其他企业的检测结果缺乏可比性。 竞争抑制化ISA是用VLP包被封闭后，加入待测血清与辣根过氧化物酶（HR巧标 记的中和单抗的混合物，室温反应后洗漆，然后加入底物进行显色检测。该方法的缺点是： 利用该方法检测中和抗体时，待测血清中不与HRP标记的中和单抗竞争VLP中特定表位的 中和抗体不能被检测到，因此在竞争抑制ELISA法中HRP标记的中和单抗应是针对VLP主 要中和表位的单抗。另外，待测血清中存在的某些非中和抗体可能会在构象上阻止VLP与 HRP标记的中和单抗结合，造成假阳性结果，默沙东（Merck)公司HPV疫苗临床试验免疫学 检测所用的是在该方法基础上改进的Luminex方法，所用的包被抗原和抑制性中和单抗都 是公司特有的，该检测结果与其他企业的检测结果缺乏可比性。 基于SEAP(分泌性碱性磯酸酶）的假病毒中和抗体检测方法：该方法通过化学发 光检测仪细胞表达分泌的SEAP来确定样本中和抗体的水平。缺点；祀细胞SEAP的本底值 较高，难于制备高滴度的假病毒，虽然能实现高通量，但操作相对较复杂，且试验成本较高， 不适用于大规模的临床试验或临床样本的流行病学调查。 基于Glue(长腹水圣巧光素酶）的假病毒中和抗体检测方法；该方法，利用了 Glue表达产物稳定和易于检测的特点，克服了基于SEAP方法的缺点，可W制备高滴度的假 病毒，并能初步实现高通量检测。缺点：该方法一次只能检测针对一种型别假病毒的中和抗 体，而现在的HPV疫苗都是多种型别抗原组成的多价疫苗（GSK的2价疫苗，Merck的4价 及9价疫苗，我国在研的多种疫苗有2价、3价、4价、6价、9价和13价疫苗），对于不同型别 抗体的检测只能分别制备改型别假病毒，进行单独检测。用该方法对于上万份的临床样本 进行多种中和抗体检测的工作量将会非常巨大。[000引世界卫生组织（WHO)在其发布的《HPVVLP疫苗质量、安全性及效力评价指导原 贝1J》指出中和实验是评价HPV疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的"金标准"。目前的试验 方法难于检测大规模临床样本的中和抗体水平，特别是对于多价HPV疫苗临床评价中和抗 体检测，亟需开发一种灵敏度高、特异性好、周期短且能实现高通量检测的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供。该方法操 作简便、检测周期短（72小时）、灵敏度高、可重复性好、结果判读客观、高通量、样品需求量 少、检测成本低、方法可标准化，便于实验室间推广、可同时检测针对多种型别病毒的中和 抗体，更接近疫苗免疫后的真实状况。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供W下技术方案： 本专利技术提供了，包括如下步骤： 步骤1 ;获得结构基因表达质粒pi化Lw和pi化Lw;步骤2;将步骤1所述结构基因表达质粒pi化Lw和结构基因表达质粒pi化Lw与巧 光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP、巧光蛋白报告质粒pRwB共转染真核表达细胞，获得假病毒； 步骤3 ;将待测样本和步骤2获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞， 表达巧光蛋白，经巧光斑点计数，获得检测样本斑点数； 步骤4 ;将培养基和步骤2获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞，表 达巧光蛋白，经巧光斑点计数，获得病毒对照斑点数； 步骤5 ;将培养基稀释，经巧光斑点计数，获得细胞对照斑点数； 步骤6 ;获得感染抑制率（％ ) =X100 ; 步骤7 ;W所述待测样本的稀释度作为X，W所述感染抑制率作为Y，用 Reed-Muench法获得所述待测样本的中和滴度IC50 ; 步骤8 ;所述待测样本的中和滴度IC50 > 40时，为HPV型特异性中和抗体阳性。 基于GFP的检测方法是经典的HPV中和抗体检测方法，其结果的判定方式主要有 两种；一是流式细胞仪读取GFP阳性细胞比例，计算抗体对病毒感染的抑制率；二是通过巧 光显微镜观察，估算GFP阳性细胞比例，计算抗体对病毒感染的抑制率。前一种方法操作繁 琐，W检测一块96孔板为例，需要90分钟左右，而且细胞消化后，会出现细胞活力降低，表 达巧光的泽灭，产生检测误差。后一种方法通过巧光显微镜观察，主观性强，并且原始检测 结果无法保留。由于上述两种结果判定方法的缺陷，国外已基本不采用该方法。巧光斑点 计数（Fluorospot)方法，虽然已被应用于细胞免疫分析，主要通过检测分泌到细胞外的细 胞因子，来分析机体的细胞免疫水平，并未应用于活细胞直接表达巧光蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得结构基因表达质粒p16LLw和p18LLw；步骤2：将步骤1所述结构基因表达质粒p16LLw和结构基因表达质粒p18LLw与荧光蛋白报告质粒PCDNA3‑GFP、荧光蛋白报告质粒pRwB共转染真核表达细胞，获得假病毒；步骤3：将待测样本和步骤2获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染真核细胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得检测样本斑点数；步骤4：和步骤2获得的假病毒稀释后与培养基混合，假病毒感染真核细胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得病毒对照斑点数；步骤5：将培养基加入真核细胞，经荧光斑点计数，获得细胞对照斑点数；步骤6：获得感染抑制率(％)＝[1‑(检测样本斑点数‑细胞对照斑点数)/(病毒对照斑点数‑细胞对照斑点数)]×100；步骤7：以所述待测样本的稀释度作为X，以所述感染抑制率作为Y，用Reed‑Muench法获得所述待测样本的中和滴度IC50；步骤8：所述待测样本的中和滴度IC50＞40时，为HPV型特异性中和抗体阳性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王佑春，聂建辉，黄维金，吴雪伶，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11