一种基于DNA水凝胶检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法技术

本发明专利技术属于疾病检测，药物分析领域。本发明专利技术涉及检测目标核酸分子，尤其是多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性（SNP）。本发明专利技术使用一种内部含有支链探针DNA的水凝胶作为检测材料。利用被检测DNA与探针DNA形成双链DNA时，单核苷酸错配的DNA（或含有多个单核苷酸变异的DNA）与完全互补的DNA之间的双链解旋温度（Tm）的差异，通过荧光染料鉴别SNP。本方法省略了各种处理和纯化步骤，具有高效，快速，结果肉眼可测等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA水凝胶检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法
：本专利技术属于疾病检测，药物分析领域。本专利技术涉及检测目标核酸分子，尤其是多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性(SNP)。
技术介绍
：DNA水凝胶分为纯DNA水凝胶和DNA与人造高分子材料杂化的DNA水凝胶。本专利技术是将DNA嵌入高分子水凝胶中，使其成为兼具DNA和水凝胶功能的智能型水凝胶，属于后者。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是由于单个碱基核苷酸改变而导致基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。包括单碱基的转换、颠换、以及单碱基的插入/缺失等。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×106个。现在普遍认为SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等诸多科研和医疗领域。目前，检测SNPs的方法主要有以下几种：1、测序方法：常规测序，Pyrosequencing(焦磷酸测序)，微测序(SNaPshot)；2、基于杂交的方法：Taqman探针法，Microarray芯片法；3、引物延伸：MALDI-Tof，dHPLC(变性高效液相色谱技术)；4、以构象为基础的方法：RFLP，SSCP，DGGE；5、溶解曲线：HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)。这些方法都需要借助相应的仪器，操作繁琐，且费用昂贵。SYBRGreenI是一种结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下或含有单链DNA时，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。除了SYBRGreenI外还有溴化乙锭(缩写EtBr，EB)，picoGreen，GelRed和GelGreen等荧光染料可用于检测双链DNA。
技术实现思路
：本专利技术提供了一种可在特定波长的光照下快速肉眼检测多个单核苷酸变异或SNP的方法。本专利技术制备并使用一种内部含有支链探针DNA的水凝胶作为检测材料。本专利技术利用被检测DNA与探针DNA形成双链DNA时，单核苷酸错配的DNA(或含有多个单核苷酸变异的DNA)与完全互补的DNA之间的双链解旋温度(Tm)的差异，通过荧光染料鉴别SNP(或多个单核苷酸变异)。本专利技术所提供的水凝胶的结构和形态如图1、2所示：其中：m、n、x的比值为1:10～50：0.00001～0.001，优选为1:20～30：0.00001～0.01，x的值是根据被检测DNA的量可调。本专利技术提供的基于DNA水凝胶检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法包括以下步骤：1)制备DNA水凝胶：该水凝胶是以甲叉双丙烯酰胺(MBAAm)为交联剂，丙烯酰胺(AAm)与甲基丙烯酰胺修饰探针DNA的共聚物为骨架的高分子水凝胶。其中甲基丙烯酰胺修饰探针DNA是通过DNA合成仪将甲基丙烯酰胺单体(制备方法参见中国专利申请2013107110031)接入到下述探针DNA序列末端制备而得的。该水凝胶性质参数同于常规的分子生物学用的聚丙烯酰胺电泳凝胶，生物相容性好，凝胶内部呈中性，有助于提高检测灵敏度和信噪比。具体的制备方案如下：在凝胶单体溶液中(AAm与MBAAm的物质的量之比为10～50:1)，加入甲基丙烯酰胺修饰探针DNA，在引发剂过硫酸铵(APS)和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)的作用下，交联成含有探针DNA的AAm含量为4～25％的DNA水凝胶。2)DNA分子杂交：将步骤1)中制得的水凝胶分别加入到含有完全互补DNA的缓冲液和被检测DNA缓冲液(含有多个单核苷酸变异或SNP)中进行分子杂交。根据所形成的双链DNA的解链温度(Tm)的差异，使完全互补DNA与含有多个单核苷酸变异或SNP的DNA在凝胶中的含量形成显著差异。3)荧光染料染色成像：将荧光染料(具体可为SYBRGreenI，溴化乙锭，PicoGreen，GelRed和GelGreen等对双链DNA具有选择性的核酸检测染料)加入到步骤2)中的缓冲液中进行染色。经特定波长的光照成像，实现SNP的肉眼鉴别。本专利技术所提供的多个单核苷酸变异或SNP的检测方法省略了各种处理和纯化步骤，具有高效，快速，结果肉眼可测等优点。本专利技术提供的方法可检测C/C、A/A、G/G、G/T、G/A、C/A、C/T、T/TSNP以及两个以上的单核苷酸错配的单链DNA。由于探针DNA固定在凝胶内部，因此可实现传感信号在凝胶块儿内的富集，从而达到高检测灵敏度(被检测DNA小于5纳克)。附图说明：图1为含有DNA的聚丙烯酰胺高分子及结构。图2为本专利技术的DNA水凝胶照片。图3为实施例2中水凝胶对C/CSNP及含有两个单核苷酸变异的被检测DNA的检测结果(从左到右依次为1-6号管)。图4为实施例3中水凝胶对A/ASNP的检测结果(从左到右为1、2、3号管)。图5为实施例4中水凝胶对G/GSNP的检测结果(从左到右为1、2、3号管)。图6为实施例5中水凝胶对G/TSNP的检测结果(从左到右为1、2、3号管)。图7为实施例6中水凝胶对G/ASNP的检测结果(从左到右为1、2、3号管)。图8为实施例7中水凝胶对C/ASNP的检测结果(从左到右为1、2、3号管)。图9为实施例8中水凝胶对C/TSNP的检测结果(从左到右为1、2、3号管)。图10为实施例9中水凝胶对T/TSNP的检测结果(从左到右为1、2、3号管)。具体实施方案：实施例1DNA水凝胶的制备过程如下：1)25％凝胶单体的制备称取2.5g(0.035mmol)AAm，0.187g(0.0012mmol)MBAAm，用灭菌水定容至10.0ml。2)4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液的制备称取0.650gHEPES，0.313gNa2HPO4·12H2O，0.800gNaCl，加入40.0ml灭菌水，用1MNaOH溶液调节pH7.0，定容至50.0ml。3)DNA水凝胶的制备量取适量25％的凝胶单体溶液，加入探针DNA溶液，震荡混匀。加入新鲜配制的10％APS水溶液，10％TEMED溶液，室温下静置30min。将凝胶浸泡在HEPES缓冲液中3h×3次。(探针DNA的浓度可以根据具体情况作出相应的改变。)水凝胶性质参数同于常规的分子生物学用的聚丙烯酰胺电泳凝胶。实施例2C/CSNP及含有两个单核苷酸变异的被检测DNA的检测：取六小块实施例1中制备的DNA水凝胶，编号1,2,3,4,5,6。用HEPES缓冲液浸泡0.5h，吸出缓冲液。1号管中加入20.0μlHEPES缓冲液，2-6号管中各加入18.0μlHEPES缓冲液，然后分别加入2.0μl的10.0μM的F-DNA，M1-DNA，M2-DNA，M3-DNA，SCR-DNA(F-DNA为与探针DNA形成的双链部分完全互补的序列；M1-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有一个C/C单核苷酸错配的序列；M2-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有两个单核苷酸错配的序列；M3-DNA为与探针DNA形成的双链部分中含有三个单核苷酸错配的序列；SCR-D本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA水凝胶检测单核苷酸变异或单核苷酸多态性中的应用，其特征在于，所述DNA水凝胶的结构如下：其中m、n、x的比值为1:10～50：0.00001～0.001。

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的基于DNA水凝胶检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法，其特征在于，联合DNA水凝胶和核酸荧光染料检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性，所述的检测包括如下步骤：(1)制备DNA水凝胶，所述DNA水凝胶的结构如下：其中m、n、x的比值为1:10～50：0.00001～0.001；(2)DNA分子杂交和控温洗涤，所述的DNA分子杂交为：将步骤1)中制得的凝胶分别加入到含有完全互补DNA的缓冲液和被检测的含有多个单核苷酸变异或SNPDNA缓冲液中，在特定温度下进行分子杂交和洗涤，在所述特定温度下，完全互补DNA与含有多个单核苷酸变异或SNP的DNA在凝胶中的含量形成显著差异；(3)核酸荧光染料染色成像，所述的核酸荧光染料为选自SYBRGreenI、溴化乙锭、PicoGreen、GelRed或GelGreen的可选择性结合双链核酸的染料。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA水凝胶是以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，丙烯酰胺与甲基丙烯...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明哲，张红利，蒋刚锋，汪伊月，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21