一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法。本发明专利技术将原代B-ALL细胞与OP9细胞共培养，可维持原代B-ALL细胞的存活率和增殖，并极大程度上缓解B-ALL细胞的分化和衰老。本发明专利技术所述培养方法培养的原代B-ALL细胞可增殖，且细胞状态良好，充分体现了肿瘤细胞的异质性。本发明专利技术所述方法操作简单，方便、经济，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法
本专利技术涉及生物领域，特别涉及一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法。
技术介绍
B细胞急性淋系白血病(B-ALL，B-cellacutelymphoblasticleukemia)，也称为前体B细胞(preB-cell)急性淋巴细胞白血病，是来源于B细胞祖细胞的恶性肿瘤。B-ALL主要为儿童高发性癌症，在成人发病率下降。在B-ALL未成年患者中预后好，长期存活率(EFS，event-freesurvival)可达90％，但在B-ALL成人中却是预后差、低生存率。另外在成年B-ALL患者中，传统的化疗的效果差，死亡率约为60％。因此，针对B-ALL，需要研发新的有效治疗方法。迄今为止，B-ALL相关研究主要依赖于B-ALL细胞系，而细胞系在长期传代培养的过程中，对高浓度血清的非人体环境中逐渐适应，并形成了一些区别于原代肿瘤细胞的基因突变和细胞特性(如高表达p53突变)。尽管病人来源的B-ALL样本细胞可以通过异种移植入免疫缺陷小鼠中扩大增殖后，进行体内实验，然而体内研究花费高、耗时长，特别是对于新型治疗方法或药物筛选实验，耗费的人力物力是不可预估的。目前已发表了一些原代B-ALL细胞体外培养的相关报道，如利用人细胞因子SCF、IL-3、IL-7和FLT-3L等刺激培养，或利用正常人骨髓内皮细胞系(HBME，humanbonemarrowendothelialcells)或人骨髓基质细胞(MSC，humanmarrowstromalcell)等进行共培养，但培养成功率低，且结果重复性差。综上所述，现有技术利用B-ALL细胞系进行肿瘤研究不能真实模拟肿瘤的异质性、无法满足随着药物使用而突变的肿瘤的治疗需求；而原代B-ALL细胞的体外培养仍处于不成熟阶段，大部分肿瘤细胞样本因无法适应体内外环境的转变而快速凋亡(2周内)，而可在成功体外长期培养的肿瘤细胞样本比率不高。因此，亟需开发稳定而有效的原代B-ALL体外培养方法，实现在病人原代肿瘤细胞进行直接、精确的实验和分析，促进B-ALL相关疾病机制研究和新型治疗手段研发进展。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种成熟、简便的原代B-ALL细胞的体外培养方法，为B-ALL的疾病机制研究、治疗药物的筛选及药效评估提供一个快速、经济、重复性高的体外模型。本专利技术利用OP9细胞系，一种小鼠骨髓来源的胚胎间充质干细胞系，与B细胞急性淋系白血病病人来源的原代B-ALL细胞共培养，使原代B-ALL细胞可在体外增殖并长期存活。本专利技术所述培养方法是一种有效、简便、利于推广的病人来源的原代B细胞急性淋系白血病(B-ALL，B-cellacutelymphoblasticleukemia)细胞的体外长期培养方法。本专利技术所述病人来源的原代B-ALL细胞的体外培养方法，可用于研究B-ALL相关的特殊基因突变、染色体重排、DNA或染色体甲基化的表观遗传变化、药物耐药性、细胞标志的表达和功能、免疫原性、细胞周期和凋亡机制、治疗药物敏感性等。同时还可用于探索B-ALL的疾病起始、B-ALL细胞分化等。实验证实，B-ALL体外培养7天后，对照组仅B-ALL已基本没有存活或状态良好的B-ALL细胞，而OP9共培养组中，还有大量的状态良好的具有完整圆形形态的B-ALL细胞，且B-ALL细胞呈现增殖状态，成团聚集并粘附于OP9细胞表面。在对照培养的条件下，B-ALL细胞7天后已几乎全部死亡，而与OP9共培养的B-ALL细胞则不断增殖，3周后平均可增殖6倍。与OP9共培养，可维持原代B-ALL细胞的存活率和增殖，并极大程度上缓解B-ALL细胞的分化和衰老。作为优选，所述原代B-ALL细胞来源于B细胞急性淋系白血病病人，更优选的，来源于B细胞急性淋系白血病病人骨髓。所述OP9细胞悬液种板长满即为OP9基质细胞培养板，所述OP9基质细胞培养板为将稀释至0.5-2×105/mL的OP9细胞在OP9培养基培养下在培养板长满；加入0.5-2×106/mL的B-ALL细胞悬液，使B-ALL细胞与OP9细胞充分接触。共培养对培养基的耗费十分快，需要每两天进行半换液(如用500ul移液器沿培养液面轻轻吸出500ul培养基后，加入500ul新鲜培养基)；须根据OP9基质细胞的状态和密度更换新鲜OP9基质细胞培养板；每天需对培养细胞状态、密度和培养基颜色进行观察，以便及时对培养情况作出相应处理方法，密切观察更换新鲜的OP9基质细胞培养板。现有的B-ALL细胞系一般为单克隆或已适应体外环境的克隆，与原代B-ALL细胞有着极大的差异，在发起癌症B-ALL、病灶转移和治疗逃逸中都无法真实反映原代B-ALL的特性；相对于现有技术中的B-ALL细胞系体外培养模型，本专利技术提供的原代B-ALL细胞体外培养方法长期培养充分体现了肿瘤细胞的异质性；且本专利技术所述B-ALL细胞系体外培养方法可真实反映肿瘤干细胞对免疫治疗、药物治疗等的适应突变和逃逸作用。相对于现有技术中的其它原代B-ALL细胞的体外培养方法，本专利技术所述培养方法，有以下优点：a)成功率更高，可达44％，更适应原代B-ALL细胞的培养；b)培养时间更长，最长可达6个月；c)培养效果更好，在培养过程中，原代B-ALL细胞数量可增殖6倍，且细胞状态良好；d)本专利技术相对于现有技术的如细胞因子培养、病人骨髓间充质细胞共培养而言，操作更加简单方便、经济，利于本专利技术的应用推广。术语与定义肿瘤异质性：是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。附图说明图1为通过显徼镜观察到B-ALL在OP9组、对照组两种条件下，B-ALL的体外生长和增殖的情况。图2为记录B-ALL细胞在OP9组、对照组两种培养条件下，每七天进行的B-ALL细胞计数结果。图3为通过显徼镜观察到B-ALL细胞与OP9共培养后0天、7天、1个月、2个月、3个月的细胞状态图。图4为与OP9共培养的B-ALL流式分析结果图。具体实施方式本专利技术公开了一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。需要说明的是，本专利中涉及到的原代B-ALL细胞来源于B细胞急性淋系白血病病人、优选来源于B细胞急性淋系白血病病人骨髓是通过中华骨髓库、血液库中获得的样本。实施例1：1.OP9细胞系的培养OP9培养基：αMEM培养基(HyClone，ThermoScientific，MA，USA)，20％胎牛血清(Gibco，LifeTechnologies，NY，USA)，2mML-glutamine，100U/mlpenicillin，and100ug/mlstreptomycin。细胞传本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法，其特征在于，将原代B‑ALL细胞与OP9细胞共培养。

【技术特征摘要】
1.一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法，其特征在于，将原代B-ALL细胞与OP9细胞共培养；所述原代B-ALL细胞来源于B细胞急性淋系白血病病人骨髓；所述共培养利用B-ALL培养基进行，所述B-ALL培养基成分包括：IMDM培养基、10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，OP9细胞悬液种板长满为OP9基质细胞培养板，加入0.5-2×106/mL的B-ALL细胞悬液，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏，蒋治武，林思妙，魏新茹，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44