本发明专利技术公开了一种核苷酸序列组合，由SEQ ID NO:1-6组成。所述组合中的核苷酸序列分别作为环介导恒温扩增技术中的外引物、内引物和环引物用于伊氏李斯特菌的鉴定方法。与普通PCR和Real-time PCR检测方法相比，本发明专利技术的方法具有优异的灵敏性、特异性、快速性和简便性，适合检测条件较差的应急检测和基层检测。
【技术实现步骤摘要】
一组核苷酸序列及在伊氏李斯特菌鉴定中的应用
本专利技术涉及环介导恒温扩增技术在细菌检测中的应用，特别是在伊氏李斯特菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。
技术介绍
伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii，Liv)，又称为绵羊李斯特菌，是广泛存在于环境中的革兰氏阳性、有运动能力、兼性胞内寄生短杆菌，是重要的人兽共患病病原菌。该病原体主要引起反刍动物致病，导致李斯特菌病的暴发和散发，约占动物李斯特菌病的15％。由伊氏李斯特菌所致的动物李斯特菌病，其临床表现为发热、胃肠炎、新生儿败血症以及流产，但不能穿过血脑屏障，侵入神经中枢系统。伊氏李斯特菌也能引起人类李斯特菌病。该李斯特菌病的易感人群主要为免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生儿和孕妇；后者为肿瘤患者、艾滋病患者和器官移植受体等。人类伊氏李斯特菌病主要临床症状为败血症、孕妇流产、死产以及发热性胃肠炎等。此外，与其他李斯特菌种比较，该病原体在环境、食品中的分布更为广泛。许多研究表明，伊氏李斯特菌所引起的李斯特菌病被低估。为了给予临床病人或感染动物准确快速的治疗、以及伊氏李斯特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的伊氏李斯特菌检测方法成为必要。目前对于伊氏李斯特菌分离鉴定主要依赖于传统的分离、培养和生化鉴定，该方法耗时大约5到7天，包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，耗时耗力，而且生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于伊氏李斯特菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些条件有限的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断伊氏李斯特菌的PCR方法和Real-timePCR方法，所选择的目的基因(如iap，Liv22-228)特异性差，极易出现假阳性扩增。此外这些检测技术的灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。环介导恒温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是由Notomi等专利技术的一种新型核酸特异性扩增技术。该技术具有灵敏度高、操作简单、产物易检测等优点，已被广泛用于分子生物研究和诊断领域。LAMP针对靶核苷酸序列的6个区域设计4条核心引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下(60～65℃)实现扩增。LAMP的4条核心引物，包括2条内引物，即FIP(Forwardinnerprimer，FIP)和BIP(Backwardinnerprimer，BIP)，2条外引物(F3和B3)。FIP包含Flc(F1区域的互补序列)和F2，即5′-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2，即5′-Blc-B2。此外，两条环引物(Loopprimes,LF和LB)被增加到反应体系，能够加速LAMP扩增反应。LAMP扩增反应包括两个过程，即哑铃状模板合成阶段和循环扩增阶段。在既定的反应温度下，双链DNA在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在BstDNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出FIP引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然后由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，该单链通过5′末端的F1c区段和F1区段互补，发生自我碱基配对，形成茎环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3′端为起点，合成互补链，在此过程中茎环结构被打开。接着，B3引物BIP引物外侧的互补区域B3c配对结合，以3′端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述2个过程，形成双链DNA。被置换的单链DNA依据两端存在的互补区域，发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条被置换出来的DNA在两端呈现哑铃状结构，该结构作为LAMP反应扩增循环的起始结构。LAMP反应扩增循环阶段：首先在哑铃状结构中，以3′末端的Fl区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应，解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成茎环结构。在茎环结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，经过相同的过程，又形成茎环结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。LAMP反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA，在1小时之内使产物的量达到109个拷贝。LAMP扩增之后，其产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状。其次，实时浊度检测也被用于检测LAMP扩增。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料(如FD试剂,朗普荧光可视试剂)，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。本专利技术针对伊氏李斯特菌的种特异基因smcL(NC_015713.1,Listeriaivanovii，Liv)设计一套环介导恒温扩增引物，旨在建立一种针对该病原的快速、敏感和特异的核酸检测体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组能够应用细菌检测，特别是环介导恒温扩增技术的核苷酸序列，更进一步提供环介导恒温扩增技术检测伊氏李斯特菌的方法，以及应用于该方法的试剂盒。基于上述目的，本专利技术首先提供了一种核苷酸序列组合，所述组合由SEQIDNO:1-6组成。所述序列是根据伊氏李斯特菌种特异性基因Smcl设计的LAMP反应引物，其中，SEQIDNO:1和2为外引物，SEQIDNO:3和4为内引物，SEQIDNO:5和6为环引物。其次，本专利技术还提供了上述的核苷酸组合在伊氏李斯特菌鉴定中的应用。再次，本专利技术又提供了一种用于检测伊氏李斯特菌的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将待检测样本、序列如SEQIDNO:1-2所示的一对外引物、序列如SEQIDNO:3-4所示的一对内引物、序列如SEQIDNO:5-6所示的一对环引物、dNTP、BstDNA聚合酶、MgSO4、甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中；(2)将步骤(1)所得的混合液放置于63℃恒温环境中进行DNA扩增反应；(3)检测步骤(3)获得的产物。在一个优选的技术方案中，所述MgSO4的浓度为4mM，所述甜菜碱的浓度为0.8mM。在一个优选的技术方案中，步骤(1)中所述待检测样本为DNA提取物。在一个优选的技术方案中，步骤(2)中所述的DNA扩增反应时间为60分钟。在一个优选的技术方案中，步骤(3)所述的检测方法可以是目测判读、琼脂糖凝胶电泳判读、或者实时浊度仪判读。优选地，在检测前在反应体系加入荧光试剂，步骤(3)所述的检测方法为目测判读。最后，本专利技术提供了一种检测伊氏李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括：序列如SEQIDNO:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核苷酸序列组合，由SEQ ID NO:1‑6组成。
【技术特征摘要】
1.一种核苷酸序列组合，由SEQIDNO:1-6组成。2.权利要求1所述的核苷酸组合在伊氏李斯特菌非诊断目的鉴定中的应用。3.一种用于非诊断目的的检测伊氏李斯特菌的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将待检测样本、序列如SEQIDNO:1-2所示的一对外引物、序列如SEQIDNO:3-4所示的一对内引物、序列如SEQIDNO:5-6所示的一对环引物、dNTP、BstDNA聚合酶、MgSO4、甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中；(2)将步骤(1)所得的混合液放置于63℃恒温环境中进行DNA扩增反应；(3)检测步骤(3)获得的产物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述MgSO4的浓度为4mM，所述甜菜碱的浓度为0.8mM。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述待检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，叶长芸，王艳，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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