本发明专利技术公开了一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，以解决角膜上皮替代物稀缺的问题。本发明专利技术采用一种转录因子基因--paired box 6基因，将其转染进入大鼠脂肪间充质干细胞，诱导细胞转分化为角膜上皮样细胞，方法清晰、简便，鉴定结果证实可靠；用本发明专利技术方法获得的角膜上皮样细胞，能够用于修复角膜上皮的损伤，并形成完整的复层角膜上皮（鉴定试验已经证实），作为一种干细胞治疗药物，具有潜在的临床应用前景；此角膜上皮样细胞，用于构建组织工程角膜上皮，具有较大的市场应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
国家统计局第二次全国残疾人调查显示，中国因角膜病致盲患者约有400万人，并以每年约10%的比例增加。受限于角膜供体的紧缺，大量角膜盲患者得不到及时的治疗。研制组织工程角膜是科研人员及企业的迫切责任和任务，无论是社会效益还是经济效益都是巨大的，甚至不可估量。组织工程角膜上皮来源的问题，是构建组织工程角膜的关键技术难点之一。建立一种安全高效的角膜上皮样细胞制造方法，将为组织工程角膜的研制与生产提供坚实基础。使用脂肪间充质干细胞作为组织工程角膜上皮的种子细胞，具有较好的临床应用优势。脂肪间充质干细胞的安全性逐渐得到认可，它具备易于取材和培养的优势，具有多向分化潜能，更易形成商品化的临床产品。本项目诱导间充质干细胞分化为上皮细胞，这种间质-上皮转变，使细胞趋向于成熟分化，更加稳定，提高了应用安全性，临床应用前景较佳。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，用于构建角膜上皮。本专利技术通过下述技术方案实现: ，是将一种转录因子基因一paired box 6 (Pax6)基因，通过脂质体介导，转染导入到大鼠脂肪间充质干细胞，此基因在细胞内表达，诱导细胞转分化，经过31天左右的时间，形成角膜上皮样细胞。期间，通过G418筛选的方法，挑选Pax6阳性表达的细胞，去除Pax6没有成功转染导入的细胞。进一步地，具体包括以下步骤: (I)采用载体 PQ3NA3.1 (+)，构建 paired box 6 质粒，其中，paired box 6 基因的 ORF序列为:ATGCAGAACAGTCACAGCGGAGTGAATCAGCTTGGTGGTGTCTTTGTCAACGGGCGGCCACTGCCGGACTCCACCCGGCAGAAGATCGTAGAGCTAGCTCACAGCGGGGCCCGGCCGTGCGACATTTCCCGAATTCTGCAGACCCATGCAGATGCAAAAGTCCAGGTGCTGGACAATGAAAACGTATCCAACGGTTGTGTGAGTAAAATTCTGGGCAGGTATTACGAGACTGGCTCCATCAGACCCAGGGCAATCGGAGGGAGTAAGCCAAGAGTGGCGACTCCAGAAGTTGTAAGCAAAATAGCCCAGTATAAACGGGAGTGCCCTTCCATCTTTGCTTGGGAAATCCGAGACAGATTATTATCCGAGGGGGTCTGTACCAACGATAACATACCCAGTGTGTCATCAATAAACAGAGTTCTTCGCAACCTGGCTAGCGAAAAGCAACAGATGGGCGCAGACGGCATGTATGATAAACTAAGGATGTTGAACGGGCAGACCGGAAGCTGGGGCACACGCCCTGGTTGGTATCCCGGGACTTCAGTACCAGGGCAACCCACGCAAGATGGCTGCCAGCAACAGGAAGGAGGGGGAGAGAACACCAACTCCATCAGTTCTAACGGAGAAGACTCGGATGAAGCTCAGATGCGACTTCAGCTGAAGCGGAAGCTGCAAAGAAATAGAACATCTTTTACCCAAGAGCAGATTGAGGCTCTGGAGAAAGAGTTTGAGAGGACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGGGAAAGACTAGCAGCCAAAATAGATCTACCTGAAGCAAGAATACAGGTATGGTTTTCTAATCGAAGGGCCAAATGGAGAAGAGAAGAGAAACTGAGGAACCAGAGAAGACAGGCCAGCAACACTCCTAGTCACATTCCTATCAGCAGCAGCTTCAGTACCAGTGTCTACCAGCCAATCCCACAGCCCACCACACCTGTCTCCTCCTTCACATCAGGTTCCATGTTGGGCCGAACAGACACCGCCCTCACCAACACGTACAGTGCTTTGCCACCCATGCCCAGCTTCACCATGGCAAACAACCTGCCTATGCAACCCCCAGTCCCCAGTCAGACCTCCTCATACTCGTGCATGCTGCCCACCAGCCCGTCAGTGAATGGGCGGAGTTATGATACCTACACCCCTCCGCACATGCAAACACACATGAACAGTCAGCCCATGGGCACCTCGGGGACCACTTCAACAGGACTCATTTCACCTGGAGTGTCAGTTCCCGTCCAAGTTCCCGGGAGTGAACCTGACATGTCTCAGTACTGGCCTCGATTACAGTAGo另外，此构建的paired box 6质粒，还具有增强型绿色焚光蛋白(EGFP)标签和G418 (Geneticin，遗传霉素)抗性，以利于质粒转染后阳性细胞的辨识和筛选。(2)将大鼠脂肪间充质干细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为0.8X 15个，向孔内加入含10%体积胎牛血清、不含抗生素的低糖型DMEM培养基，并将培养板置于37°C、5%C02的细胞培养箱中进行培养； (3)接种24h后，采用阳离子脂质体介导质粒DNA转染，并使其形成含有上述质粒的混合液，并将其加入到上述培养板的培养孔中，每孔加入的DNA为0.5 μ g ;混合液加入4?6h后，更换培养基(采用含10%体积胎牛血清、不含抗生素的低糖型DMEM培养基)，继续培养； (4)48h后，将上述培养基换成含有600yg/ml G418的培养基，每3天(d)更换一次培养基，1d后将存活的阳性细胞克隆在培养板盖上进行标记，刮除其他细胞，将培养基中的G418浓度降为300 μ g/ml，继续培养20d，挑选阳性克隆并采用有限稀释法筛选，筛选出的细胞，即为角膜上皮样细胞。另外，本专利技术对细胞进行了鉴定(判断筛选得到的细胞是否为角膜上皮样细胞)。鉴定依据:细胞形态依据:角膜上皮细胞呈铺路石状，而脂肪间充质干细胞为梭状；特征蛋白分子依据(最关键依据):角膜上皮细胞的特征蛋白分子是细胞角蛋白3(cytokeratin 3，CK3)、细胞角蛋白 12 (cytokeratin 12，CK12);另外，E-Cadherin 蛋白作为上皮细胞的标志，可以作为角膜上皮细胞特征的辅助依据；细胞移植依据:角膜上皮细胞在角膜表面能够形成角膜上皮。鉴定方法:细胞形态在倒置显微镜下观察和拍摄；分子鉴定主要通过Westernblot法与细胞免疫荧光染色法，其中CK3+12的多克隆抗体采用北京博奥森生物技术有限公司(目录号:bs 2369R)，E-Cadherin单克隆抗体购自abeam公司(目录号:ab76055);细胞移植鉴定主要观察细胞移植于兔眼后形成角膜上皮的能力。鉴定结果: ①Pax6蛋白在细胞的表达情况:Western blot法检测显示:携带EGFP的Pax6蛋白在实验组呈阳性表达。对照组细胞为大鼠脂肪间充质干细胞，实验组细胞为大鼠脂肪间充质干细胞经过Pax6转染并筛选后所得的细胞。见图1。②细胞形态观察显示，经过Pax6质粒转染并G418筛选，原先为梭状的大鼠脂肪间充质干细胞(对照组)，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，其特征在于，将一种转录因子基因‑‑paired box 6（Pax6）基因，导入到大鼠脂肪间充质干细胞，诱导细胞发生转分化，形成角膜上皮样细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘漪沦，刘卫华，罗永慧，印长尹，叶俊儒，刘海荣，杨艳秋，
申请(专利权)人：刘漪沦，
类型：发明
国别省市：四川;51
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