联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片及制备方法技术

本发明专利技术公开了联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片及制备方法，其属于液相蛋白芯片的技术领域。该液相蛋白芯片包括经过羧基功能化或者生物素华的聚苯乙烯微球，在微球上包被纳米金颗粒层以及在纳米金颗粒层嵌设量子点，其中选择五种标记了不同发射波长的量子点的微球分别偶联M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K的单克隆抗体。通过该技术，能够同时检测结直肠癌的M2-PK、K-ras、APC、AKT和PI3K标记物，可用于检测结直肠癌的早期事件，灵敏度高，特意性强，检测方法可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及液相蛋白芯片的
，尤其是涉及能够同时检测五个结直肠癌的特异性标记物的液相蛋白芯片。本专利技术涉及的另外一个方面就是液相蛋白芯片的制备方法。
技术介绍
结直肠癌是世界上常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率排第三位，近年来，随着人们生活水平的提高以及饮食结构的改变，其发病率呈明显上升趋势。但是，目前国内外对结直肠癌的早期诊断仍处于较低水平，约半数的患者明确诊断时已进入中期和晚期结直肠癌。因此，提高结直肠癌的早期诊断是目前国内外迫切需要解决的关键问题。目前早期诊断结直肠癌有以下几种的常用技术:(I)大便隐血试验是结肠癌常用的筛查方法，操作简便、无创，主要缺点是灵敏度低、特异性差。(2)电子结肠镜(简称内镜)是发现及诊断结直肠癌最有效的手段，也是目前早期诊断结直肠癌的主要方法，尤其是在高危人群的检查具有重要的临床价值。因其为创伤性检查伴有出血、肠穿孔等危险的副作用、且需要一定的设备和仪器，对操作人员的专业水平要求较高，故在大范围人群的检查存在着很大的局限性。(3)电化学发光技术检测常用肿瘤标记物:如CEA、CA199、CA242、CA50，因其阳性率低，缺乏特异性(66.7% )，不合适用于结直肠癌的早期诊断。(4)采用PCR技术检测患者血清或粪便内的DNA和检测微小RNA的浓度对结直肠癌治疗监测和预后评价有一定的价值，但它们在应用于结直肠癌的早期诊断方面还有待于进一步研宄。近年来，国内外学者开始致力于寻找敏感、特异、可靠、有效的结直肠癌新生物标记物以及建立无创伤性检查和专利技术方法来提高早期诊断结直肠癌的诊断率。有研宄显示，M2型丙酮酸激酶(M2-PK)在胃肠肿瘤的发生、发展和代谢中发挥重要的作用。与正常组织相比，胃癌组织中M2-PK表达升高，与患者低生存率相关。国外学者认为肿瘤M2-PK在血浆、粪便检测其灵敏度(90.7% )和特异性(96.3% )较高，且与疾病分期和淋巴结转移相关，有望成为结直肠癌新型肿瘤标记物，尤其是在粪便的检测其临床价值更大。M2-PK主要以两种形式存在，即高活性的四聚体形式和低活性的二聚体形式。前者主要存在于分化的组织和正常增殖的细胞中，而后者常存在于肿瘤细胞中，与底物亲和力低，促使肿瘤细胞内糖代谢中间体如磷酸烯醇类物质等积累，对肿瘤细胞的增殖具有重要作用。结直肠癌是一种多基因性疾病，在发生发展过程中涉及到相关基因的改变如:K-ras、APC等基因突变。国外学者报道K_ras基因突变与结直肠癌密切相关，是结直肠癌的早期分子事件。APC基因突变与早期结直肠癌和腺瘤的诊断有较大的临床价值，尤其是在高危人群早期诊断具有重要意义。近年来我国学者提出富含亮氨酸重复测序G蛋白耦联受体5 (LGR5)，是一种干细胞分子标记物，也是Wnt信号通路的靶基因之一，其表达量的增加能够促进胃肠黏膜的自我更新，LGR5在结直肠癌组织中呈高水平的表达。目前有研宄提出AKT和PI3K基因突变可作为肿瘤的早期诊断、确定肿瘤的浸润范围以及判断预后的重要指标。近年来，有研宄表明MXRAS有可能成为对大肠癌前病变早期诊断的有实用价值的肿瘤标记物。由于结直肠癌在遗传学上是多步骤、多阶段、多基因改变的过程，多基因联合检测对提高检出率及检测敏感性更有重要意义，故本项目根据病人的需要可单指标或多指标联合检测，在结直肠癌早期诊断和筛查中发挥重要作用。本项目研发的试剂成本较低以及病人支出的费用也得到降低，符合我国新医改医疗计划中对加强基层医院和社区医疗服务中心的要求。另外，随着量子技术的发展，越来越适应生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因组学以及蛋白质组学等研宄。特别的，量子点纳米标记荧光不仅能特异性靶向肿瘤部位，还能通过荧光强弱反映出其活跃程度，可应用于肿瘤的早期诊断和监测疗效。现有的技术中，关于结直肠癌的检测基本都是基于单个标记物指标进行检测或者只是针对量子编码微球、或者针对结直肠癌的后期检测诊断，难以满足社会发展的需要。例如中国专利公告号为中国专利申请号CN100342034C披露了-种大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片及其制备的方法，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的大肠癌蛋白。提出生物芯片技术可以实现把多个结直肠癌的蛋白表达进行一次检测。不足之处是:该申请号专利只对大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片及其制备的方法进行描述，没有研宄成熟的早期诊断结直肠癌的特异性标记物，缺乏专一性。中国公告号为CN 1164238A披露了一种对人结肠癌相关蛋白抗原的单克隆抗体，是特异性对人类具有免疫原性的结肠癌相关抗原的糖蛋白抗原的鼠/人嵌合抗体可用于人结肠癌、乳癌和卵巢癌的免疫诊断。该专利没有成熟的早期诊断结直肠癌标记物，缺乏专一性。中国专利公告号为CN 101003835B披露了一种用于大肠癌检查的基因组合的检测方法，该方法通过在基因群中的至少2种以上的基因或者基因产物的表达量，筛选检测样品中的大肠癌细胞。该专利同样存在不足:(1)通过销售商业的基因芯片，价格昂贵，不适合临床的广泛应用。(2)使用多种技术:基因芯片、多重RT-PCR技术等，需要设计特异性探针和引物，操作繁琐、费时费力，也不合适应用于临床。(3)同样存在没有成熟的早期诊断结直肠癌标记物，缺乏专一"性。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的一个方面是提出一种联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，其目的解决现有的结直肠癌的检测只能针对癌症后期检测，且针对性不强，检测速度慢、检测数据不准确等的问题。为了解决上述的技术问题，本专利技术提出的基本技术方案为:包括直径和材料相同的随机排列在微通道内的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球；所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球均包被有纳米金颗粒层并且该纳米金颗粒层嵌设有量子点，其中每种微球的纳米金颗粒层中嵌设的量子点的发射波长互不相同；所述第一微球通过共价方式偶联M2-PK单克隆抗体形成M2-PK量子点荧光探针，所述第二微球通过共价方式偶联K-ras单克隆抗体形成K-ras量子点荧光探针，所述第三微球通过共价方式偶联APC单克隆抗体形成APC量子点荧光探针，所述第四微球通过共价方式偶联AKT单克隆抗体形成AKT量子点荧光探针，所述第五微球通过共价方式偶联PI3K单克隆抗体形成PI3K量子点荧光探针。本专利技术的另外一个方面即提供一种用于制备上述的联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片的方法。具体的，其制备方法的步骤为:A:活化处理，各取400 μ I第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球进行活化处理；B:纳米金包被，各取0.25g经过活化处理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分别加入胶体金中，离心处理使得第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球的外表面包被纳米金颗粒层；C:量子点标记，将经过步骤B处理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球分别加入2mL量子点中振荡15分钟，得到量子点标记的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球，其中每种微球所使用的量子点的发射波长互不相同；D:探针偶联，各取经过步骤C处理的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球0.0lg分别加入到含有M2-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种联合检测五个结直肠癌标记物的液相蛋白芯片，其特征在于：包括直径和材料相同的随机排列在微通道内的第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球；所述第一微球、第二微球、第三微球、第四微球和第五微球均包被有纳米金颗粒层并且该纳米金颗粒层嵌设有量子点，其中每种微球的纳米金颗粒层中嵌设的量子点的发射波长互不相同；所述第一微球通过共价方式偶联M2‑PK单克隆抗体形成M2‑PK量子点荧光探针，所述第二微球通过共价方式偶联K‑ras单克隆抗体形成K‑ras量子点荧光探针，所述第三微球通过共价方式偶联APC单克隆抗体形成APC量子点荧光探针，所述第四微球通过共价方式偶联AKT单克隆抗体形成AKT量子点荧光探针，所述第五微球通过共价方式偶联PI3K单克隆抗体形成PI3K量子点荧光探针。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何凤屏，
申请(专利权)人：深圳市森塔医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44