本发明专利技术公开了一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提供了柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP检测的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP，以待测样品总DNA为模板，应用上述的内外引物对在63～65℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60～80min，扩增完成后78～82℃反应5～10min中止反应，然后根据浑浊度或利用荧光染料染色通过颜色变化或电泳条带进行可视化判断，鉴定植株样品是否感染柑桔褪绿矮化相关病毒。本发明专利技术操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器，几十分钟就可完成对样品的检测，重复性好、准确性高、灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种环介导等温扩增分子检测方法，尤其涉及 一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
柑桔褪绿矮化病由柑桔褪绿矮化相关病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus, CCDaV)引起，CCDaV 属于菜豆金黄花叶病毒属（Begomovirus)， 为单链环状的DNA病毒，基因组为3. 4-3. 6kb，具有5个ORFs。柑桔褪绿矮化病主要分布于 土耳其，近年来我国相继在云南、四川等地发现了柑橘褪绿矮化病，其发生呈不断扩大、加 重的趋势，可通过杨梅粉虱（Parabemisia myricae Kuwana)传播。CCDaV可侵染多种柑桔 寄主，如葡萄柚、柠檬、栊柑、酸橙及甜橙等，引起植株叶片变形、扭曲、花叶等症状，并造成 果实变小，产量降低。该病在土耳其被认为是威胁柑桔生产最严重病害之一，且已经在土耳 其造成了严重的损失，特别是在梅尔辛造成当地柑桔减产60~70%。 目前我国柑桔的种植面积和产量均居世界第一，柑桔已成为我国农民增收的重要 途径，也是我国一个重要的产业。柑桔褪绿矮化病已在我国时有发生，且日趋严重，对柑桔 产业是一个巨大的威胁，且该病目前尚无有效的药物可进行防治，因此柑桔褪绿矮化病的 防控对我国柑桔产业的发展具有十分重要的意义。 柑桔褪绿矮化病的检测，目前可用的方法有：常规PCR和实时荧光PCR。PCR法具 有快速、灵敏和准确的特点，作为一种强有力的检测工具已广泛应用于各种病害的检验与 诊断，实时荧光PCR的灵敏度高于常规PCR。PCR方法虽然能对CCDaV进行有效的检测，但 都需要专业的PCR仪、电泳仪等特殊仪器，使其在田间和基层的应用受到很大的限制。因此 建立一套快速、有效、简便的柑桔褪绿矮化病的检测方法，对我国柑桔产业健康、稳定发展 具有十分重要的意义。 2000年由Notomi等专利技术的环形介导逆转录等温扩增技术（LAMP)是一种新的恒温 核酸扩增方法，较传统的核酸扩增方法具有灵敏度高、特异性强、操作方法简单、快速等优 点，现已越来越多的应用于各种病毒的检测。其主要原理是通过采用特异地识别靶序列上 6个区域的4条引物（2条内引物-FIP/BIP，2条外引物-F3/B3)及链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)，在等温条件下（60-65°C左右）DNA开始合成。利用可以产生环状结构的 引物和Bst DNA聚合酶的链置换合成活性，靶序列两端引物结合处循环不断地产生环状单 链结构。当一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链解离变成单链， 引物在恒温条件下不断引发新链的合成，靶基因因此得到高效扩增，最终的扩增产物是一 系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳显现 出不同大小条带组成的阶梯式图谱。该方法可加入荧光燃料进行可视化判断也可根据浑浊 度判断检测结果，反应也不需要特殊仪器，在烘箱或水浴锅中就能完成反应，因此特别适合 在田间和基层使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP 引物组。 -种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组，由外引物对F3、B3和内引物对 FIP、BIP 组成： 外引物对： F3 :5' -ACCAGGAGTGGAGGACAAT-3' ； B3 :5, -CCTTACACCCCGGAGGAA-3,； 内引物对： FIP :5' -ACCTGGGCCTCCTTCTTCTCTTGGGACAAGCCGTGTAACG-3' ； BIP :5' -AGAAGCCCAAGATTGCTGGGGACCTTTGCTCGACTTTCTCC-3'。 本专利技术的另一目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性的柑桔褪绿矮化相关病毒 的LAMP检测试剂盒。 一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测试剂盒，含有前述的柑桔褪绿矮化相关 病毒的 LAMP 检测引物组、Bst buffer、MgCl2、Betaine、dNTPs、Bst 聚合酶。 本专利技术还提供了一种不需要专门的核酸扩增和检测仪器、操作简单方便、特异性 好、灵敏度高、检测快速的柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP检测方法。 一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测方法，是以待测样品总DNA为模板，应用 上述的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP在63~65°C恒温反应条件下，进行环介导恒 温扩增反应60~80min，扩增完成后78~82°C反应5~IOmin中止反应，然后根据浑浊度 或荧光染料染色或电泳条带，鉴定植株样品是否感染柑桔褪绿矮化相关病毒。 扩增反应中，总体积25yL的反应体系含有18yL反应液A、5yL引物液B、浓度 为 20 ~IOOng/yL 的 DNA 溶液 2 yL ;其中 18 yL反应液 A 含有：2. 5 yL IOXBst buffer、 6以1^251111的]\%(：12、2 41^41111的86七&1116、3.5 41^1〇1111的(1阶138、141^8"41^的88七聚合 酶、3yL 水；所述5yL 引物'液B包括 2yL 20μΜ 的 FIP、2yL 20μΜ 的BIP、0.5yL ΙΟμΜ 的 F3、0. 5 yL 10 μΜ 的 Β3。 本专利技术的有益效果是：以待测样品总DNA为模板，建立了快速检测柑桔褪绿矮化 相关病毒的LAMP技术，操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器和电泳仪，几十分 钟就可完成对样品的检测，其主要优点有： (1)本专利技术首次提供了柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒和方 法，所述的引物特异性良好，对于柑桔褪绿矮化相关病毒能够实现特异性扩增，而对于其它 病毒不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。 (2)可快速、准确、大批量地检测柑桔褪绿矮化相关病毒，所需样品量少；本专利技术 方法敏感性极高，10-15分钟的短时间内DNA模板数量可增加至IO 9倍，是一种反应快速，操 作简便的快速检测技术，适应于检测对象的快速筛检。 (3)灵敏度高：实验证明本专利技术检测方法检测灵敏度比常规PCR高100倍，具有与 实时荧光PCR相等的检测灵敏度。 (4)本专利技术为田间和基层单位对柑桔褪绿矮化相关病毒的检测提供了一种高效、 快速、成本低、准确、灵敏的检测方法，填补柑桔褪绿矮化相关病毒现场快速检测方法的空 白。【附图说明】 图1为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP浑浊度可视化检测结果示意图；1为感染柑桔 褪绿矮化相关病毒的样品，2为健康叶片对照，3为水对照。 图2为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP引物组的特异性检测图；其中1为感染柑桔褪 绿矮化相关病毒的样品，2-7分别为感染柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病类病毒、 温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒和柑桔黄龙病菌的样品。 图3为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP扩增产物酶切鉴定图；M为50bp Ladder DNA Marker ; 1、3为LAMP扩增产物；2为LAMP扩增产物经Mbo II酶切后电泳。 图4为柑桔褪绿矮化相关病毒常规PCR(上排泳道）和LAMP (下排泳道）本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组，其特征在于：由外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP组成：外引物对：F3：5’‑ACCAGGAGTGGAGGACAAT‑3’；B3：5’‑CCTTACACCCCGGAGGAA‑3’；内引物对：FIP：5’‑ACCTGGGCCTCCTTCTTCTCTTGGGACAAGCCGTGTAACG‑3’；BIP：5’‑AGAAGCCCAAGATTGCTGGGGACCTTTGCTCGACTTTCTCC‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘科宏，周常勇，李中安，陈洪明，周彦，
申请(专利权)人：西南大学柑桔研究所，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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