本发明专利技术公开了一种A型和B型沃尔巴克氏体的荧光检测引物及其检测方法和检测试剂盒。利用本发明专利技术的荧光检测引物按照本发明专利技术的检测方法能够快速高效专一的检测出A型和B型沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高(只检测出伊蚊沃尔巴克氏体，而且能分别出是A型还是B型还是A、B混合型沃尔巴克氏体，而库蚊沃尔巴克氏体不发生扩增)，灵敏度高，其最低检测限为100copies/ml。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种伊蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物及 其检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
： 沃尔巴克氏体（Wolbachia)是广泛分布于节肢动物体内的共生微生物，它可能是 昆虫共生微生物中最为丰富的类群。它分布于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞 翅目等昆虫种类中。它以垂直传播作为其在宿主世代间传递的基本模式。它稳定地存在于 宿主的生殖细胞内，通过卵细胞传递给宿主子代，并可通过多种方式如细胞质不亲和、雌性 化和杀雄性等调控宿主的生殖活动。通过这些调控作用促进其在宿主种群内广泛传播。 在沃尔巴克氏体（Wolbachia)引起的宿主生殖行为改变中，细胞质不亲和 (Cytoplasmic Incompatibility，Cl)是最常见的一种类型。它表现为当被沃尔巴克氏 体（Wolbachia)感染的雄蚊与未感染雌蚊或感染不同种类Wolbachia的雌雄蚊交配时，精 子和卵子结合后胚胎无法发育。沃尔巴克氏体（Wolbachia)的胞质不亲和的特性可导致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同种Wolbachia的蚊群进行种群压制和种群替 代。它的应用对蚊媒病防治具有巨大的价值。近期研宄发现，沃尔巴克氏体（Wolbachia) 不仅具有上述的特性外，同时它还能在蚊子体内与蚊子携带的一些重要的病原生物（如 登革病毒，疟原虫等）相互作用，抑制它们在蚊子体内的增值和扩散从而在阻断这些病原 生物传播于人类。沃尔巴克氏体（Wolbachia)的这种抑制作用与它在蚊子体内组织的分 布相关，所以，了解沃尔巴克氏体（Wolbachia)在蚊子体内组织分布有助于快速筛选出传 播阻断效果最好的沃尔巴克氏体（Wolbachia)感染的蚊子，也有助于监测沃尔巴克氏体 (Wolbachia)在蚊群中的垂直传播，同时也有利于高效率地监测大规模大地域范围的沃尔 巴克氏体（Wolbachia)在蚊子组织中的感染情况。 在自然界中，蚊子的种类有很多，常见的有伊蚊和库蚊两种。伊蚊分为白纹伊蚊和 埃及伊蚊，其中埃及伊蚊不携带沃尔巴克氏体。由于沃尔巴克氏菌只能存活于宿主体内，不 能在体外自由生活，因而如何有效特异地检测沃尔巴克氏菌是对该细菌研宄的必备工具。 比较常用的检测手段有聚合酶链反应法（PCR法）和免疫染色法。免疫染色法耗时耗力，而 且特异性不好。随着PCR方法的普及，针对沃尔巴克氏体的检测有了很大的进步。不同蚊 种携带不同的沃尔巴克氏体，通过PCR结果能够直观的看出蚊子携带的不同沃尔巴克氏体 类型，这样为我们的日常检测提供了很大的便利。目前针对不同沃尔巴克氏体PCR检测的 方法还不完善。
技术实现思路
： 本专利技术的目的是提供一种专一性强、特异性高和灵敏度高的A型和B型沃尔巴克 氏体的荧光检测引物。 本专利技术的A型和B型沃尔巴克氏体的荧光检测引物，其特征在于，包括 (1)针对A型沃尔巴克氏体： wAlbAF :5' -CCAGATACTATTGCAGACAGTTTAA-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所 示）； wAlbAR :5'-CAACACCAATATATGGAGTGATA-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示）； 探针 A :5' -CCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所 示）； 探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ; (2)针对B型沃尔巴克氏体： wAlbBF :5' -CGATATCAGGGTTGATGTTGA-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 所示）； wAlbBR :5'-CAATCGCTATATCGTAATAAACG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示）； 探针 B :5' -CCAACAACTGTTGCAAACAGTGTGG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 6 所 示）； 探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQl。 本专利技术的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的A型和B型沃尔巴克 氏体的检测方法，其特征在于，提取样品DNA，以该样品DNA为模板，使用上述A型和B型沃 尔巴克氏体的荧光检测引物wAlbAF、wAlbAR、探针A、wAlbBF、wAlbBR和探针B，进行荧光定 量PCR扩增，扩增反应完成后，根据探针标记的荧光发生基团的荧光信号，读取并记录样品 的PCR循环次数Ct，根据样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品是否含有A型和B型 沃尔巴克氏体的。 所述的进行荧光定量PCR扩增，其反应条件优选为：预变性50°C 5分钟，95°C 15 分钟；扩增94°C 15秒、55°C 45秒，40个循环；55°C的时候收集焚光信号。 本专利技术的第三个目的是提供一种A型和B型沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括荧 光检测引物和PCR试剂，其特征在于，所述的荧光检测引物为： (1)针对A型沃尔巴克氏体： wAlbAF :5' -CCAGATACTATTGCAGACAGTTTAA-3' ； wAlbAR :5' -CAACACCAATATATGGAGTGATA-3' ； 探针 A :5' -CCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATC-3' ； 探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl ; (2)针对B型沃尔巴克氏体： wAlbBF :5' -CGATATCAGGGTTGATGTTGA-3' ； wAlbBR :5' -CAATCGCTATATCGTAATAAACG-3' ； 探针 B :5' -CCAACAACTGTTGCAAACAGTGTGG-3' ； 探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQl。 利用本专利技术的荧光检测引物组按照本专利技术的检测方法能够快速高效专一的检测 出A型和B型沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高（只检测出伊蚊沃尔巴克氏体，而且 能分别出是A型还是B型还是A、B混合型沃尔巴克氏体，而库蚊沃尔巴克氏体不发生扩 增），灵敏度高，其最低检测限为l〇〇copies/ml。 因此，本专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便等优点。【附图说明】： 图1是伊蚊A型沃尔巴克氏体的灵敏度的实验结果图，其中I、II、III、IV分别代表 DNA抽提液，10、100、1000倍稀释的DNA抽提液； 图2是伊蚊B型沃尔巴克氏体的灵敏度的实验结果图，其中I、II、III、IV分别代表 DNA抽提液，10、100、1000倍稀释的DNA抽提液； 图3是伊蚊沃尔巴克氏体的重复性的实验结果图，其中I、11分别代表不同的蚊 子的扩增曲线； 图4是FAM检测通道对A型沃尔巴克氏体的特异性的实验结果图； 图5是FAM检测通道对B型和wPip型沃尔巴克氏体（库蚊沃尔巴克氏体）的特 异性的实验结果图； 图6是HEX检测通道对B型沃尔巴克氏体的特异性的实验结果图； 图7是HEX检测通道对A型和wPip型沃尔巴克氏体（库蚊沃尔巴克氏体）的特 异性的实验结果图。【具体实施方式】： 以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。 实施例1 :灵敏本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种A型和B型沃尔巴克氏体的荧光检测引物，其特征在于，包括(1)针对A型沃尔巴克氏体：wAlbAF：5’‑CCAGATACTATTGCAGACAGTTTAA‑3’；wAlbAR：5’‑CAACACCAATATATGGAGTGATA‑3’；探针A：5’‑CCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATC‑3’；探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；(2)针对B型沃尔巴克氏体：wAlbBF：5’‑CGATATCAGGGTTGATGTTGA‑3’；wAlbBR：5’‑CAATCGCTATATCGTAATAAACG‑3’；探针B：5’‑CCAACAACTGTTGCAAACAGTGTGG‑3’；探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨翠，高秀洁，奚志勇，朱俭，罗永平，
申请(专利权)人：奚志勇，
类型：发明
国别省市：广东;44
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