具有蛋白酶活性的多肽和编码它的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对序列表的引用本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景本专利技术涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本专利技术还涉及包含这些核酸序列的核酸构建体，载体和宿主细胞(包含植物和动物细胞)，以及生产和使用(尤其在动物饲料和洗涤剂中使用这些蛋白酶)这些蛋白酶的方法。相关技术说明本专利技术提供具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。多年来，洗涤剂工业已经在洗涤剂配制品中应用了不同酶，最常用的酶包括蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶，每种酶适于除去不同类型的污物。除这些酶之外，洗涤剂组合物典型地包括成分的复合物组合。例如，大多数清洁产品包括表面活性剂体系、漂白剂或助洗剂。不管当前洗涤剂的复杂度如何，但是对于研发包括新的酶和/或酶共混物的新的洗涤剂组合物仍存在需要。传统地，已经在升高的温度下进行洗涤，并且已经选择熟知的洗涤剂在较高的温度下进行。对改进洗涤过程以便使得它们更环保的增加的聚焦导致如下全球趋势：降低洗涤时间、pH和温度，并且减少可能负面地影响环境的洗涤剂组分的量。因此存在希望，例如希望在较低温度下洗涤，并且因此对在不同条件下(例如在低温下)具有高性能的洗涤剂蛋白酶存在需要。在动物饲料中使用蛋白酶(体内)，和/或这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白(体外)的用途中，注意的是蛋白对于动物和人类是必需营养因子。大部分家畜和许多人从植物性蛋白来源获得这些必需蛋白。重要的植物性蛋白来源是例如油籽作物、豆类和谷类。当例如大豆粉包含在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当比例的大豆粉固体未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠蛋白消化率仅是80％左右)。动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的段组成。在单胃动物如猪和家禽以及许多鱼中，胃展现了低至pH 1-2的强酸性pH，而肠展现了在pH 6-7范围内的一个更中性的pH。除了胃和肠之外在胃之前家禽还具有一个嗉囊，该嗉囊中的pH主要取决于咽下的饲料并因此典型地处于pH 4-6的范围内。通过一种蛋白酶消化蛋白可发生在整个消化道中，假如该蛋白酶是有活性的并存活于该消化道的条件下的话。因此，以下这样的蛋白酶是特别令人希望的：它是高度地酸稳定的以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的宽的生理pH下是有效地有活性的。另外，动物饲料常常是以丸形式配制的，其中在该造丸过程中采用蒸汽。因此以下也是令人希望的，在动物饲料中使用的蛋白酶能在暴露于蒸汽处理之后保持活性。在动物饲料中使用蛋白酶以改善饲料中蛋白的消化是已知的。WO95/28850披露了一种植酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶组合以改善植物性蛋白的溶解度。WO 01/58275披露了枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 01/58276披露了与以下蛋白酶相关的酸稳定性蛋白在动物饲料中的用途：衍生自拟诺卡菌NRRL 18262(10R蛋白酶)的蛋白酶，连同衍生自白拟诺卡氏菌DSM 14010的一种蛋白酶。WO04/072221、WO 04/111220、WO 04/111223、WO 05/035747以及WO05/123911披露了与10R蛋白酶相关的蛋白酶及其在动物饲料中的用途。另外，WO 04/072279披露了其他蛋白酶的用途。WO 04/034776披露了一种枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶，来自地衣芽孢杆菌的PWD-1，在家禽饲料中的用途。WO 04/077960披露了一种通过采用一种细菌或真菌蛋白酶增加草料或谷物在反刍动物中的消化率的方法。包含一种蛋白酶的并且销售以用于在动物饲料中使用的商业产品包含ProAct(DSM NP/诺维信公司(Novozymes))、(丹尼斯克公司(Danisco))、(丹尼斯克公司)、(丹尼斯克公司)、AllzymeTM(奥特奇公司(Alltech))、(生物资源有限公司(BioResources,Int.)、PoultrygrowTM(杰夫公司(Jefo))和DP100(诺伟思公司(Novus))。专利技术概述本专利技术涉及具有蛋白酶活性的一种分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；(c)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。本专利技术还涉及编码本专利技术多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。本专利技术还涉及本专利技术的蛋白酶在动物饲料和清洁过程，生产动物饲料组合物和洗涤剂组合物的方法，以及动物饲料组合物和洗涤剂组合物中的用途。本专利技术还涉及编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸-185至-157或由其组成的信号肽的一种多核苷酸、编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸-156至-1或由其组成的前肽的一种多核苷酸、或编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸-185至-1或由其组成的信号肽和前肽的一种多核苷酸，其每一者被可操作地连接至编码一种蛋白质的基因；涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体、以及重组宿主细胞；以及涉及产生一种蛋白质的方法。序列表综述SEQ ID NO:1是来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的DNA序列SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列SEQ ID NO:3是成熟变孢指孢囊菌蛋白酶的氨基酸序列。SEQ ID NO:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；(c)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.21 EP 12198994.11.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组
由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少78％、至少
79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、
至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少
91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、
至少98％、至少99％或100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:
1的成熟多肽编码序列具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至
少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少
87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、
至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序
列一致性；
(c)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(例
如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；以及
(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2
的成熟多肽或由其组成。
3.如权利要求2所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸
1至187。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的成熟
多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入。
5.一种包括如权利要求1-4中任一项所述的多肽的组合物。
6.如权利要求5所述的组合物，是一种洗涤剂组合物，例如用于衣物洗
涤或自动餐具洗涤的一种组合物。
7.如权利要求6所述的组合物，进一步包括选自以下项的多种另外的酶
中的一种：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖
酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加
过氧酶(haloperoxygenase)、过氧化氢酶、甘露聚糖酶，或其任何混合

\t物。
8.如权利6或7所述的组合物，包括选自以下项的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·贝尼，P·R·厄斯特加德，M·吉杰曼森，T·霍夫，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK