本发明专利技术公开了一种用于检测大肠杆菌的引物及其方法和应用，所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，针对所涉及的引物，建立了大肠杆菌的检测方法，其具有特异性良好、灵敏较好、检测快速可靠、操作简单的特点，同时设计包含该引物的试剂盒，便于大肠杆菌的检测。本发明专利技术针对大肠杆菌的特异基因LafF设计特异引物，该引物可以快速、简便、准确的检测大肠杆菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种用于检测大肠杆菌的引物及其应用。
技术介绍
大肠埃希氏菌（Escherichia coli)习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于 埃希氏菌属。大部分大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌，食物或水中大肠杆菌 的检出意味着直接或间接的近期粪便污染。大肠杆菌作为饮水、食品等的粪源性污染卫生 细菌学指标；而且其在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近。它的出现也可能预示某 些肠道病原菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）的存在。大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示 菌，因此大肠杆菌的检测技术显得十分重要。 传统的大肠杆菌的检测方法有常规涂片镜检法、培养法等，但是这些方法存在一 定的缺陷，如常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；培养法 是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，但一般需4到7天的时间，操作繁琐，费时耗 力，不能实现快速的目的。 本专利技术利用生物信息学寻找出大肠杆菌特异基因，并针对其设计引物，建立了大 肠杆菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出大肠杆菌的目的。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的缺陷，提出了一种用于检测大肠杆菌的基因，通过生物信 息学手段获取该可用于鉴定大肠杆菌的特异基因，并针对该基因涉及引物。 本专利技术的另一目的在于针对所涉及的引物，建立了大肠杆菌的检测方法，其具有 特异性良好、灵敏较好、检测快速可靠、操作简单的特点。 本专利技术的第三个目的在于提供一种检测大肠杆菌的试剂盒，便于大肠杆菌的检 测。 本专利技术具体通过以下技术方案实现： -种用于检测大肠杆菌的引物，包括上游引物和下游引物，所述的上游引物核苷 酸序列如SEQ ID NO :1所示，所述的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。 通过实验证明，本专利技术提供的检测引物对大肠杆菌具有良好的特异性，该检测引 物针对的靶基因片段LafF基因。 一种检测大肠杆菌的方法，包括以下步骤： 1)提取待检测样品的t旲板DNA ; 2)设计上述所述的引物； 3) PCR 扩增： 反应体系：Taq 0· 125 μ L，IOX 聚合酶缓冲液 2. 5 μ L，dNTP 2 μ L，Mg2+L 6 μ L，模 板I yL，上下游引物各I yL，加 ddH20补足25yL ; 反应条件：95°C 5min ;95°C 30s，57°C 30s，72°C 20s，30 个循环；72°C Imin ; 4)利用琼脂糖凝胶电泳方法判断检测结果。 一种用于检测大肠杆菌的试剂盒，包括引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2,具体为： IOX聚合酶缓冲液2.5 μ L，dNTP 2 μ L，Mg2+L 6 μ L，模板1 μ L，上下游引物各1 μ L，CldH2O 25 μ L0 本专利技术的有益效果为：针对大肠杆菌的特异基因 LafF设计特异引物，该引物可以 快速、简便、准确的检测大肠杆菌。【附图说明】 图1是不同退火温度和MgC12浓度对大肠杆菌PCR反应的影响；M :2000bp DNA Marker ;1 :MgCl2浓度 0· 8mM ;2 :MgCl2浓度 I. 6mM ;3 :MgCl2浓度 2. 4mM ;4 :MgCl2浓度 3. 2mM ; 5 :MgCl2浓度 4. OmM ; 图2是大肠杆LafF菌基因特异性检测电泳图；M :2000bp DNAMarker ;1~3 :三株 不同的大肠杆菌菌株；4 :肺炎克雷伯菌；5 :弗劳地氏枸橼酸杆菌；6 :伤寒杆菌泳道；7 :琼 氏不动杆菌；8 :表皮葡萄球菌；9 :粪肠球菌；10 :溶血葡萄球菌；11 :金黄色葡萄球菌；12 : 摩氏摩根菌； 图3是大肠杆菌LafF基因灵敏度检测电泳图；M :2000bp DNAMarker ;1~10 :每 微升模板中质粒的数目，1~10分别对应IO9个/ μ L~10 °个/ μ L ;11 :阴性对照。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施 例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。 实施例1特异性靶基因筛选及引物设计： 1)本地 BLAST 分析 从 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genome/)中下载的大肠杆菌全基因组 序列，对本地的核酸数据库进行本地BLAST检索，获取得到大肠杆菌各序列片段与数据库 比对结果。 2) BLAST 重确认 使用在线BLAST功能，使用2种策略确认其菌种特异性和大肠杆菌鉴定可用性。一 种策略为BLAST时排除大肠杆菌，结果显示无任何相似序列者为大肠杆菌特异基因；第二 种策略为BLAST时选择在大肠杆菌内进行检索，结果返回大量相似序列者是不同大肠杆菌 菌株共有序列。结合两种策略，最终得出基因 LafF如SEQ ID NO :3所示，符合两种策略标 准。 3)引物设计 针对大肠杆菌LafF基因，设计特异引物：gaagaaaatcgtggtggcgg和 gtcggttttccttttccggc〇 实施例2检测方法的建立 1)DNA 的提取 用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒进行 抽提回收，步骤如下： (1)取细菌培养液5mL，12, OOOrpm离心1分钟，尽量吸净上清。 (2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μ L细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡 器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37°C温浴30分钟。每隔10分钟颠倒混匀数次。12, OOOrpm离心 2分钟，尽量吸净上清。 (3)向菌体沉淀中加入225 μ L缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮。 (4)向管中加入6 μ L RNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟。 (5)向管中加入10 μ L蛋白酶K溶液，颠倒混匀。 (6)加入25 μ L裂解缓冲液S，颠倒混匀。 (7)加入250 μ L缓冲液Β，振荡10秒，70°C放置10分钟。12, OOOrpm离心1分钟， 取上清放入一新管中，弃去沉淀。 (8)加入250 yL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离 心以去除管盖内壁的水珠。 (9)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）， 12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。 (10)向吸附柱中加入500 μ L缓冲液C，12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱 放入收集管中。 (11)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱 放入收集管中。 (12)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱 放回收集管中。然后12, OOOrpm离心2分钟。将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，室 温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 (13)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测大肠杆菌的引物，包括上游引物和下游引物，其特征在于：所述的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛小琴，刘有福，宋玉竹，牛华，夏雪山，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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