本发明专利技术公开了一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的基因芯片，它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1、3、4所示基因片段，用于分别检测伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型。本发明专利技术公开了一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒。本发明专利技术基因芯片和试剂盒可以有效检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型病原，还能区分猪伪狂犬病毒的疫苗株与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存期长等特点，耗时短，检测快速，检测结果的观察直观，无需昂贵的设备，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况，临床应用前景良好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的可视化基因 芯片以及检测方法。
技术介绍
随着我国养猪业向集约化和规模化方向发展，规模化猪场疫病多发、多种病原 混合感染较普遍存在，给养猪业造成了一定损失。其中猪伪狂犬病毒（PRV)、猪细小病毒 (PPV)和猪圆环病毒2型（PCV2)是引起猪繁殖障碍的三种重要疫病病原。这三种病临诊症 状相似，需要进行鉴别诊断。 目前，对这三种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长， 也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别三种病毒的方法。因此，有 必要建立能同时进行三种疫病快速检测的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测猪伪狂犬 病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的可视化基因芯片和试剂盒。 基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、 抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的 生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。 本专利技术检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的可视化基因芯片，它 包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :1、3、4所示基因片 段，用于分别检测伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型。 它还包括SEQ ID NO :2所示所示探针，用于检测伪狂犬病毒野毒株。 它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO :6所示。 一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，它包括前述的 基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO :7~8、SEQ ID NO :11~12、SEQ ID NO :13~14所示引物对，用于分别扩增伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的基 因。 它还包括SEQ ID NO :9~10所示引物对，用于扩增伪狂犬病毒野毒株的基因。 所述SEQ ID NO :7、9、11和13所示上游引物标记有生物素。 本专利技术还提供了 SEQ ID NO :7 ~8、SEQ ID NO :9 ~10、SEQ ID NO :11 ~12、SEQ ID NO :13~14所示引物对以及SEQ ID NO :1~4所示基因片段。 本专利技术还提供了 SEQ ID NO :1、3、4所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒、猪细 小病毒和猪圆环病毒2型的基因芯片的用途。 其中，所述基因芯片还包括SEQ ID NO :2所示所示探针，用于检测伪狂犬病毒野毒 株。 本专利技术还提供了 SEQ ID NO :7 ~8、SEQ ID NO :9 ~10、SEQ ID NO :11 ~12、SEQ ID NO :13~14所示引物对以及SEQ ID NO :1~4所示基因片段在制备检测猪伪狂犬病毒、 猪细小病毒和猪圆环病毒2型中的用途；其中，四对引物对为扩增试剂，SEQ ID NO :1~4 所示基因片段为检测探针。 本专利技术基因芯片和试剂盒可以有效检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒 2型病原，还能区分猪伪狂犬病毒的疫苗株与野毒株感染，具有特异性好、灵敏性高和保存 期长等特点，耗时短，检测快速，检测结果的观察直观，无需昂贵的设备，可以迅速掌握畜禽 疫病的感染情况，临床应用前景良好。 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。【附图说明】 图1 :阵列排布示意图 图2:点阵设置图示 图3 :样品设置图示 图4 :芯片预杂交的组装图示 图5 :芯片特异性检测结果A:PRV检测结果；B:PPV检测结果；C:PCV2检测结果； D:PRV+PPV检测结果；E:PRV+PPV检测结果；F:PRV+PCV2检测结果 图6 :gB探针基因不同稀释度芯片灵敏性检测结果 图7 :gE探针基因芯片灵敏性检测结果 图8 :NS1探针基因芯片灵敏性检测结果 图9 :0RF2探针基因芯片灵敏性检测结果 图10 :稳定性检测结果【具体实施方式】 实施例1本专利技术检测方法 一、探针基因的设计以及包含探针的质粒菌的构建 1 材料 Ll 种毒 PRV Fa株，由卫生部成都生物制品研宄所惠赠； PCV2由本实验室赵春容从四川资阳病料中分离； 猪细小病毒灭活疫苗购自北京中海科技动物保健科技公司。 1. 2探针基因重组质粒菌 T/GAPDH由英骏生物公司合成。 1. 3主要实验仪器 电子天平：Sartorius BP 310S ; 超纯水仪：Milli Qplus，法国产； 超净工作台：SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司； 恒温摇床：真空机：SinBo,香港； 恒温水浴锅；Thermo Savant冷冻干燥仪； 核酸蛋白检测仪：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3010 ; 高速冷冻离心机3K18型：Sigma&，德国产； Mini-SUB凝胶电泳装置，电泳仪：POWER Pac300,凝胶电泳图像分析系统2000型： Bio-RADR〇，意大利产； 梯度 PCR 仪：PX 2, Thermo hybaid ;分子杂交仪：Thermo,美国产； 晶芯? SmartArrayer?48 (微阵列芯片点样系统），晶芯? LuxScan?10K微阵列芯 片扫描仪： Capitalbio Corporation，北京博奥生物有限公司； 高纯氮气瓶：四川冠峰气体有限公司生产。 1. 4主要试剂 Plasmid miniprep Kit，Gel Extractraction Kit，均购自 Omega (美国）生物技 术有限公司； 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、50bp DNA LadderUOObp DNA Ladder、 2XTaq PCR MasterMix、DH5a感受态细胞-化学转化，Amp均购自北京天根生化科技有限公 司； PUC18Cloning Vector，pMD19-T Simple克隆试剂盒，均购自宝生物（大连）科技 有限公司； LB 液体培养基（含 100mg/ml Amp) ;LB 平板（含 100mg/ml Amp)等。 Western Blot膜封闭液，购自天根生物科技有限生司； Streptavidin-HRP，DAB Kit (Brown)购自英駿生物科技有限公司； Baio ?点样缓冲液，购自上海百傲生物工程有限公司； 预杂交缓冲液：甲酰胺 50ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd' s 5ml、脱脂奶粉 5g、 0· 2M Na3PO4IOml,超纯水定容至 100ml ; 杂交缓冲液，甲酰胺45ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd's 1ml、脱脂奶粉2g、20m M Na3PO4 (pH 6· 5) 10ml，超纯水定容至 100ml ; 尼龙膜，购自GE Healthcare ;硝酸纤维素膜，购自Millipore. 0· 2M PBS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的基因芯片，其特征在于：它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1、3、4所示基因片段，用于分别检测伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：文心田，曹三杰，常晓霞，黄小波，文翼平，伍锐，张仙，马锐，杨国淋，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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