具有显著促进牛前脂肪细胞增殖生物功能的miRNA-2400，属于细胞生物学技术领域，通过对牛前脂肪细胞进行体外分离培养，采用免疫荧光染色法鉴定牛脂肪前体细胞，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miRNA-2400的表达量，采用EdU检测miRNA-2400对前脂肪细胞增殖的影响；其特征在于在牛前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miRNA-2400表达量明显下降；miRNA-2400过表达后，前脂肪细胞增殖率明显提高，与增殖相关的基因CCND1表达量明显上升；结果表明：miRNA-2400是一种在调解脂肪细胞发育过程中具有显著促进前脂肪细胞增殖作用的小RNA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及具有显著促进牛前脂肪细胞增殖生物功能的miRNA-2400,属于细胞生 物学
技术介绍
前脂肪细胞的分化与增殖，是导致肥胖的直接因素。利用体外培养的前脂肪细胞 研宄细胞的增殖与分化规律，是近年来科研人员常用的方法。体外前脂肪细胞的培养是研 宄脂肪组织的理想模型。研宄家畜脂肪蓄积情况，对于探讨脂肪代谢相关疾病，优化家畜 肌肉品质具有重要价值。本研宄对牛的前脂肪细胞进行分离，建立其体外培养的方法，并 诱导分化使其成为成熟的脂肪细胞，对脂肪细胞中的标志性分子脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARy)进行免疫荧光染色，以证明分离 的前脂肪细胞的性质和纯度。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase, LPL)是一种脂肪细胞的 特征蛋白，是脂肪细胞早期分化的标志基因 （Couturier et al, 1998)。LPL能够将血液中 乳糜微粒和极低密度脂蛋白所携带的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸，向有关组织提供合成 甘油三酯所需的原料，对脂肪沉积起着重要的调控作用（Mead et al，2002)。过氧化物酶体 增殖物激活受体（PPAR)家族是影响脂肪细胞分化和脂质代谢的主要核内转录受体，有3种 亚型，即PPARa、PPAR β (亦称PPAR δ )和PPARy，它们在结构、功能及组织分布上均有差 异。其家族成员PPARy是目前所知唯一在脂肪组织中高水平表达的转录因子，对脂肪细胞 的分化有重要调节作用。PPARγ在脂肪细胞分化的早期即在大多数脂肪细胞基因转录激活 前即有表达，在脂肪细胞分化过程中，PPAR γ表达水平不断升高，到成熟脂肪细胞表达最高 (程安玮等，2009)。MicroRNA (miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，是发 夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有 多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基 因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个 miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研宄的逐步深入， 将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。miRNA广泛 存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框（ORF)。 成熟的miRNA，5^端有一个磷酸基团，3'端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长的 pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前 体（pre-miRNA)并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5 ^端的磷酸基团和3'端轻 基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA 5 '端第一个碱基对U(尿 苷）有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基 外，其他位置碱基通常都缺乏C。这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合， 有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式 是身体调苄基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。成熟 的miRNA-2400的核酸序列为：CCAGCACAGGCAGCUCGGACUGA，目前国内外还没有miRNA-2400 是否具有促进牛前脂肪细胞增殖生物学功能的相关报道。如何研宄miRNA-2400是否具有 促进牛前脂肪细胞增殖的生物学功能成为急需解决的一大难题？所以，专利技术具有显著促进 牛前脂肪细胞增殖生物功能的miRNA-2400,研宄miRNA-2400是否具有促进牛前脂肪细胞 增殖的生物功能是必要的。
技术实现思路
为了研宄miRNA-2400是否具有促进牛前脂肪细胞增殖的生物功能的难题，本发 明提供了具有显著促进牛前脂肪细胞增殖生物功能的miRNA-2400,本专利技术对牛前脂肪细 胞进行体外分离培养，并采用免疫荧光染色法鉴定牛脂肪前体细胞，在牛的前脂肪细胞分 化为脂肪细胞的过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miRNA-2400的表达量，构建能够 使miRNA-2400过表达的真核表达载体，采用EdU检测miRNA-2400对前脂肪细胞增殖的影 响；结果为：在牛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中，随着分化天数和分化程度的增 加，miRNA-2400的表达量明显下降，miRNA-2400过表达后，前脂肪细胞的增殖率明显提高， miRNA-2400过表达后，与增殖相关的基因 CCNDl表达量明显上升；结果表明：miRNA-2400 是一种在调解脂肪细胞发育过程中具有显著促进前脂肪细胞增殖作用的小RNA。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是： 具有显著促进牛前脂肪细胞增殖生物功能的miRNA-2400通过对牛前脂肪细胞 进行体外分离培养，采用免疫荧光染色法鉴定牛脂肪前体细胞，在牛的前脂肪细胞分化为 脂肪细胞的过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miRNA-2400的表达量，采用EdU检测 miRNA-2400对前脂肪细胞增殖的影响；结果为：在牛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程 中，随着分化天数和分化程度的增加，miRNA-2400的表达量明显下降，miRNA-2400过表达 后，前脂肪细胞的增殖率明显提高，miRNA-2400过表达后，与增殖相关的基因 CCNDl表达量 明显上升；结果表明：miRNA-2400在调解脂肪细胞发育过程中具有显著促进前脂肪细胞增 殖的作用。 所述的免疫荧光染色法鉴定牛脂肪前体细胞的鉴定结果：采用50纳摩尔每升的 胰岛素和100纳摩尔每升的地塞米松，进行脂肪前体细胞的诱导分化，在诱导分化7天后， 荧光显微镜下观察到PPARy和LPL在细胞中的表达情况。结果表明，在前脂肪细胞分化为 脂肪细胞后，PPARy和LPL在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研宄分离培养的为前脂 肪细胞，且具有分化为脂肪细胞的能力。 所述的在牛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR 检测miRNA-2400的表达量，方法为选取出于对数生长期的前脂肪细胞，将其进行细胞传代 培养操作，传至12孔细胞培养板，用胰岛素和地塞米松诱导分化4天、7天、10天，收集细 胞，检测miRNA-2400表达量。实验结果：在牛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中，随着 分化天数和分化程度的增加，miRNA-2400的表达量明显下降。表明miRNA-2400在调解脂 肪细胞发育过程中具有一定的作用。 所述的EdU检测miRNA-2400对前脂肪细胞增殖的影响：选取出于对数生长期的前 脂肪细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至24孔板，待细胞贴壁后，采用PEI法进行前脂 肪细胞的转染，pcDNA3. I (+)、pcDNA3. I (+) -miRNA-2400 (含有 miRNA-2400 的过表达载体）， miRNA-2400的抑制剂，48h后EdU检测其增殖情况。同时采用荧光定量RT-PCR的方法检测 增殖相关重本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有显著促进牛前脂肪细胞增殖生物功能的miRNA‑2400，通过对牛前脂肪细胞进行体外分离培养，采用免疫荧光染色法鉴定牛脂肪前体细胞，在牛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中，采用茎环荧光定量RT‑PCR检测miRNA‑2400的表达量，采用EdU检测miRNA‑2400对前脂肪细胞增殖的影响；其特征在于：在牛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miRNA‑2400的表达量明显下降，miRNA‑2400过表达后，前脂肪细胞的增殖率明显提高，miRNA‑2400过表达后，与增殖相关的基因CCND1表达量明显上升；结果表明：miRNA‑2400是一种在调解脂肪细胞发育过程中具有显著促进前脂肪细胞增殖作用的小RNA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：严云勤，佟慧丽，李树峰，魏瑶，张伟伟，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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