一种脐血内皮祖细胞的分离培养方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及内皮祖细胞分离培养技术领域，特别涉及一种脐血内皮祖细胞的分离培养方法及其试剂盒。该方法包括：将脐血单个核细胞预先贴壁培养，取未贴壁的细胞进行细胞培养，细胞培养的培养基为含有胎球蛋白的完全培养基。本发明专利技术提供的方法培养的脐血内皮祖细胞比传统方法得到的细胞，形态方面更为均一，细胞汇合度更高，细胞收获量更大，细胞增殖更为迅速，细胞表面抗原表达率更高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及内皮祖细胞分离培养
，特别涉及一种脐血内皮祖细胞的分离培养方法及其试剂盒。
技术介绍
心脑血管疾病就是心脏血管和脑血管的疾病统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生缺血性或出血性疾病。是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍可有50 %以上的脑血管意外幸存者生活不能完全自理，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。因此，急需一种能够有效防治心脑血管疾病的治疗策略。脐带血是婴儿出生后，留在胎盘和脐带中的血液，含有丰富的干细胞。其主要含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。除此以外，脐血中的单个核细胞经过诱导培养，还可以得到内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。内皮祖细胞是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与人胚胎血管生成，而且最近几年研宄发现EPCs也参与出生后的血管新生过程，提示EPCs在缺血性疾病、创伤愈合中的重要治疗作用和广阔的临床运用前景。近年来研宄发现，EPCs在心血管疾病、肢体缺血性疾病的治疗中发挥重要作用，因此，体外EPCs可作为血管新生的“替代策略”广泛应用于临床。此外EPCs容易获取、操作简单、定向移植(归巢)于血管生成部位，所分化生成的内皮细胞是最接近于血流的一层细胞，释放出的活性物质容易通过血流扩散到全身，从而发挥广泛的作用，因此EPCs还是基因治疗理想的靶细胞。EPCs可来源于脐血、骨髓、外周血，Schmidt D等报道脐血来源的EPCs具有体外增殖活性，这些细胞持续表达内皮细胞表型。提示脐血来源的EPCs可以作为组织工程理想的自体细胞来源。然而，每份脐血所含内皮祖细胞有限，为了满足治疗性移植要求，需进一步体外扩增EPCs。现有的血液中内皮祖细胞分离培养方法一般采用将培养皿包被，之后从血液中分离出单个核细胞后贴壁培养，该方法效率低，仅能从血液分离到少量的内皮祖细胞，之后的扩增效率亦较低，细胞增殖较慢。因此，提供一种收获量大且增殖迅速的脐血内皮祖细胞的分离培养方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种脐血内皮祖细胞的分离培养方法及其试剂盒。本专利技术提供的方法培养的脐血内皮祖细胞比传统方法得到的细胞，形态方面更为均一，细胞汇合度更高，细胞收获量更大，细胞增殖更为迅速，细胞表面抗原表达率更高。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案:本专利技术提供了一种脐血内皮祖细胞的分离培养方法，包括如下步骤:将脐血单个核细胞预先贴壁培养，取未贴壁的细胞进行细胞培养，细胞培养的培养基为含有胎球蛋白的完全培养基。本专利技术将脐血单个核细胞预先贴壁培养后，再取未贴壁的细胞进行分离培养EPCs，分离培养的培养基中添加胎球蛋白，促进EPCs的贴壁、增殖。本专利技术提供的方法培养的脐血内皮祖细胞比传统方法得到的细胞，形态方面更为均一，细胞汇合度更高，细胞收获量更大，细胞增殖更为迅速，细胞表面抗原表达率更高。作为优选，胎球蛋白的浓度为0.5?5mg/mL。优选地，胎球蛋白的浓度为lmg/mL。在本专利技术提供的一些实施例中，胎球蛋白为胎球蛋白B。作为优选，细胞培养的时间为5?10天。优选地，细胞培养的时间为8天。作为优选，预先贴壁培养的时间为12?36h。优选地，预先贴壁培养的时间为24h。在本专利技术提供的一些实施例中，预先贴壁培养的培养基为含有10% FBS的DMEM培养基。在本专利技术提供的一些实施例中，预先贴壁培养的培养基中还含有生长因子，生长因子为VEGF、FGF、IGF或EGF中的一种或几种。在本专利技术提供的一些实施例中，预先贴壁培养的培养基中含有20ng/mL VEGF,20ng/mL FGFUng/mL IGFUOng/mL EGF。在本专利技术提供的一些实施例中，预先贴壁培养的培养皿为明胶包被的培养皿。作为优选，预先贴壁培养的细胞密度为107/mL。在本专利技术提供的一些实施例中，预先贴壁培养是在37°C、5% CO2、饱和湿度条件下进行。在本专利技术提供的一些实施例中，在细胞培养之后还包括采用消化酶消化内皮细胞集落、传代培养的步骤。在本专利技术提供的一些实施例中，消化酶为胰酶。在本专利技术提供的一些实施例中，脐血单个核细胞的制备方法为:取脐血与PBS混合，离心，弃上清及脂肪层，细胞沉淀用PBS重悬，加入淋巴细胞分离液，离心，获得脐血单个核细胞。本专利技术还提供了一种分离培养脐血内皮祖细胞的试剂盒，包括胎球蛋白、含有10% FBS的DMEM培养基。在本专利技术提供的一些实施例中，胎球蛋白为胎球蛋白B。在本专利技术提供的一些实施例中，试剂盒还含有生长因子，生长因子为VEGF、FGF、IGF或EGF中的一种或几种。在本专利技术提供的一些实施例中，试剂盒还含有消化酶。 在本专利技术提供的一些实施例中，消化酶为胰酶。在本专利技术提供的一些实施例中，试剂盒还含有淋巴细胞分离液。本专利技术提供了一种脐血内皮祖细胞的分离培养方法及其试剂盒。该方法包括:将脐血单个核细胞预先贴壁培养，取未贴壁的细胞进行细胞培养，细胞培养的培养基为含有胎球蛋白的完全培养基。本专利技术提供的方法培养的脐血内皮祖细胞比传统方法得到的细胞，形态方面更为均一，细胞汇合度更高，细胞收获量更大，细胞增殖更为迅速，细胞表面抗原表达率更高。【附图说明】图1示PO代细胞形态；其中，Al图示本专利技术实施例1方法培养2天的EPCs，A2图示本专利技术实施例1方法培养9天的EPCs，A3图示本专利技术实施例1方法培养13天的EPCs ；BI图示传统方法培养2天的EPCs，B2图示传统方法培养9天的EPCs，B3图示传统方法培养13天的EPCs ；图2示细胞的增殖曲线；图3示细胞表面抗原Vwf_cy2的表达率；其中图A示传统方法分离培养EPCs的表面抗原Vwf-cy2表达率；图B示本专利技术实施例1方法分离培养细胞的表达率。【具体实施方式】本专利技术公开了一种脐血内皮祖细胞的分离培养方法及其试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的脐血内皮祖细胞的分离培养方法及其试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术:实施例1脐血EPCs的分离与培养脐血取自足月健康新生儿的脐带，加入复方枸橼酸钠(CPD-A)抗凝，采集后在24h内进行分离当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脐血内皮祖细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将脐血单个核细胞预先贴壁培养，取未贴壁的细胞进行细胞培养，所述细胞培养的培养基为含有胎球蛋白的完全培养基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，黎娟妹，王小燕，李平，何炜均，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44