RSV F融合前三聚体制造技术

公开了含有RSV F胞外域多肽的复合物和用于制备所述复合物的方法。所述RSV F胞外域多肽可以呈融合前形式。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】RSV F融合前三聚体 相关申请 本申请要求2012年11月20日提交的美国专利申请号61/728, 498以及2013年10月 11日提交的美国专利申请号61/890, 086的权益。上述申请的完整教导通过引用并入本文。 序列表 本申请含有已经以ASCII形式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述 ASCII 拷贝，在 2013 年 11 月 18 日生成，名为 PAT055275-TO-PCT_SL.txt，大小为 76, 359 字 T。 专利技术背景 呼吸道合胞病毒（RSV)是副粘病毒科肺炎病毒属 中的包膜不分节负链RNA病毒。其为儿童出生后第一年中儿童间细支气管炎和肺炎的主要 原因。RSV还引起重复感染，包括严重下呼吸道疾病，其可在任何年龄发作，特别是在老年人 或心脏、肺或免疫系统受损的人中。 为了感染宿主细胞，副粘病毒诸如RSV，像其它包膜病毒诸如流感病毒和HIV，需 要病毒膜与宿主细胞的膜融合。对于RSV，保守融合蛋白（RSV F)通过偶联不可逆的蛋白重 折叠和膜并置来融合病毒和细胞膜。在基于副粘病毒研宄的现有模型中，所述RSV F蛋白 最初折叠为亚稳态"融合前"构型。在细胞进入过程中，所述融合前构型经历重折叠且构型 变化为其稳定的"融合后"构型。 RSV F蛋白由mRNA翻译为约574个氨基酸的蛋白，称为Fp Ftl的翻译后加工包括 通过内质网中的信号肽酶去除N端信号肽。反式高尔基体中的细胞蛋白酶（特别是弗林 蛋白酶（furin))还在两个位置（约109/110和约136/137)切割F。。该切割导致短干扰序 列的去除并且产生两个保持彼此结合的亚单位，称为F 1^SOkDa ;C端；约残基137-574)和 F2 (~20kDa ;N端；约残基1-109)。F1在其N端含有疏水性融合肽和还有两个两亲性七肽重 复区域（HRA和HRB)。HRA接近所述融合肽，HRB接近所述跨膜结构域。三个F 1-F2异源二 聚体在病毒颗粒中组装为F1-F2同源三聚体。 现在还未获得但期望针对RSV感染的疫苗。生产疫苗的一种可能方法是基于纯化 的RSV F蛋白的亚单位疫苗。然而，对于该方法，期望纯化的RSV F蛋白是随时间稳定的单 一形式和构型，在疫苗批次之间一致且方便纯化。 RSV F蛋白可被截短，例如通过缺失跨膜结构域和胞质尾，以允许其表达为可以可 溶的胞外域。此外，尽管RSV F蛋白最初翻译为单体，但该单体被切割且组装为三聚体。当 RSV F蛋白为切割的三聚体形式时，暴露所述疏水性融合肽。不同三聚体例如可溶性胞外域 三聚体上的所述暴露的疏水性融合肽可彼此结合，导致形成玫瑰花结型。所述疏水性融合 肽也可与例如来自用于表达重组可溶RSV F蛋白的细胞的脂质和脂蛋白结合。由于RSV F 蛋白加工、结构和重折叠的复杂性，难以获得纯化的、均质的免疫原性制备物。 RSV F的融合前形式含有在融合后形式上不存在的表位。参见，例如，Magro，M.等 k，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109 (8) : 3089-94 (2012))。因此，对于疫苗，稳定的 融合前形式通常被认为是抗原性上更期望的。已经使用GCN-稳定化的一般方案产生了几 种RSV F构建体。然而，在每种情况下，无论HRB是否用GCN、工程改造的二硫键或设计以加 强三聚体HRB疏水核心相互作用的点突变稳定化，结果是无法从细胞有效表达和输出的蛋 白。制备具有对其弗林蛋白酶切割位点的突变以防止融合肽释放的融合后RSV F的尝试导 致RSV F无法形成与在充分研宄的副流感病毒F中观察到的三聚体类似的三聚体。 因此，需要改善的RSV F蛋白组合物和用于制备RSV F蛋白组合物的方法。 专利技术概述 本专利技术涉及呼吸道合胞病毒F (RSV F)复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽（每个包 含内源HRA区域），和至少一个寡聚化多肽，其中三个胞外域多肽和至少一个寡聚化多肽形 成六螺旋束，条件是RSV F多肽的内源HRA区域不是六螺旋束的部分。任选地，每个RSV F 胞外域多肽可以包含HRB区域，且每个寡聚化多肽可以包含寡聚化区域。六螺旋束可以包 含每个RSV F胞外域的HRB区域和每个寡聚化肽的寡聚化区域。寡聚化区域可以包含RSV F HRA氨基酸序列。任选地，所述复合物可以由三个RSV F胞外域多肽和三个寡聚化多肽 组成。所述寡聚化多肽中的一个或多个可以进一步包含可操作连接至寡聚化区域的功能性 区域。所述功能性区域可以独立地选自免疫原性载体蛋白、抗原、颗粒形成多肽、脂质和可 以使寡聚化多肽与脂质体或微粒结合的多肽。所述功能性区域可以是抗原。所述抗原可 以是RSV G。任选地，所述RSV F胞外域多肽中的一个或多个是未切割的RSV F胞外域多 肽。任选地，所述RSV F胞外域多肽中的一个或多个是切割的RSV F胞外域多肽。任选地， 所述RSV F胞外域多肽中每个含有一个或多个改变的弗林蛋白酶切割位点。任选地，所述 RSV F胞外域多肽中的一个或多个可以包含WO 2011/008974(其整体通过引用并入本文） 中先前描述的氨基酸序列或突变。所述RSV F胞外域多肽的氨基酸序列可以包含选自以下 的序列：SEQ ID N0:8 (Del21 Furx)、SEQ ID N0:3 (Furmt)、SEQ ID N0:4 (Furdel)、SEQ ID N0:5 (Furx)、SEQ ID N0:6 (Furx R113Q、K123N、K124N)、SEQ ID N0:7 (Furx R113Q、 K123Q、K124Q)、SEQ ID N0:9 (Delp23Furx)、SEQ ID N0:10 (Delp21 furdel)、SEQ ID N0:11 (Delp23 furdel)、SEQ ID N0:12 (N 端弗林蛋白酶）、SEQ ID N0:13 (C 端弗林蛋白酶）、 SEQ ID NO: 14 (因子Xa)、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 26 (融合肽缺失I)和其中省略信 号肽和/或HIS标签的任何上述物质。所述RSV F胞外域多肽中的至少一个可以是包含C 端6螺旋束形成部分的重组多肽。C端六螺旋束形成部分可以包含包膜病毒的融合蛋白的 七肽重复区域。所述七肽重复区域可以是来自包膜病毒的I型融合蛋白的HRA或HRB。例 如，所述七肽重复区域可以选自RSV F HRA、RSV F HRB和HIV gp41 HRA。任选地，所述六 螺旋束包含三个重组RSV F胞外域多肽的C端6螺旋束形成部分和每个寡聚化肽的寡聚化 区域。所述RSV F胞外域多肽可以呈融合前构型。所述RSV F复合物的特征可在于当在负 染电子显微图中观察时的圆形。所述RSV F复合物可以包含RSV F的融合后形式上不存在 的融合前表位。 本专利技术还涉及呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽 (每个含有内源HRA区域和内源HRB区域），所述RSV F胞外域多肽中的至少一个进一步包 含C端6螺旋束形成部分，其中所述复合物的特征在于由C端6螺旋束形成部分和内源HRB 区域形成的六螺旋束。 本专利技术还涉及用本文档来自技高网...

【技术保护点】
呼吸道合胞病毒F(RSV F)复合物，其包含三个RSV F胞外域多肽各自包含内源HRA区域，和至少一个寡聚化多肽，其中所述三个胞外结构域多肽和所述至少一个寡聚化多肽形成六螺旋束，条件是所述RSV F多肽的内源HRA区域不是六螺旋束的部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A卡尔菲，K斯万逊，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE