基因取代微生物及使用该微生物的聚酯制造方法技术

本发明专利技术的目的是提供下述重组微生物株，所述重组微生物株能够在产业用发酵过程中稳定地高性能地生产聚羟基链烷酸(PHA)。本发明专利技术为存在于微生物的染色体上的聚羟基链烷酸合成酶基因被外源性聚羟基链烷酸合成酶基因取代而得到的重组微生物株。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是基于申请日为2006年7月21日，申请号为200680055421. 8 (PCT/ JP2006/314498)，专利技术名称为""的专利申 请的分案申请。
本专利技术涉及经改良的微生物株、以及利用该微生物株的PHA制造方法，所述改良 的微生物株在微生物降解聚酯的聚羟基链烷酸（PHA)的商业生产上是有用的。
技术介绍
聚羟基链烷酸是可由多种微生物产生的聚酯型有机分子聚合物。这些聚合物是具 有生物降解性的、热塑性高分子，此外，其可以由可再生资源生产，因而，进行了将其作为环 境和谐型材料或生物适应型材料进行工业生产，应用于各个产业的尝试。 构成该聚酯的单体通用名为3-羟基链烷酸，具体地，通过使3-羟基丁酸、3-羟基 吉草酸、3-羟基己酸、3-羟基辛酸、或者更长烷基链的3-羟基链烷酸单独重合或共聚来形 成聚合物分子。作为3-羟基丁酸（以下，简称为3HB)的均聚合物的聚3-羟基丁酸（以下， 简称P(3HB))，P(3HB)是1925年在巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium)中首次发现的， 但该P(3HB)的结晶性高，其性质硬且脆，其应用范围受到了实用性的限制。因此，进行了以 改良其性质为目的地研宄。 这其中，公开了由3-羟基丁酸（3HB)、3_羟基吉草酸（3HV)构成的共聚体（以下， 简称P (3HB-CO-3HV))的制造方法（例如，参照专利文献1、专利文献2)。该P (3HB-CO-3HV) 较P(3HB)更富柔软性，因此，可以认为其具有更广泛的应用。然而，实际上，即使增加3HV 的摩尔比率，P (3HB-CO-3HV)的物性也缺乏随之发生的变化，特别是柔软性并不提高，因此， 其只能应用在洗发液瓶、一次性剃刀的把手等硬质成型体领域。 此外，已知由烷基链的碳原子数为6~16的3-羟基链烷酸构成的中链PHA，与 P(3HB)、P(3HB-c〇-3HV)相比结晶性低、富有弹力（参照非专利文献1)、可以期待其在不同 领域的应用。在中链PHA的制造研宄方面，进行了下述研宄：将假单胞菌属（Pseudomonas) 的PHA合成酶基因导入假单胞菌属、雷氏菌属（Ralstonia)、大肠杆菌，但生产性均低，不适 用于工业生产（参照非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4)。 近年来，进行了 3HB和3-羟基己酸（以下，简称3HH)的2成分共聚聚酯（以 下，简称P(3HB-c〇-3HH))及其制造方法的研宄（参照专利文献3、专利文献4)。这些 报告中的P(3HB-c〇-3HH)制造方法是这样的：使用从土壤中分离出的豚鼠气单胞菌 (Aeromonas caviae)，从油酸等脂肪酸或橄榄油等油脂进行发酵生产。此外，还开展了关 于P(3HB-c〇-3HH)的性质的研宄（参照非专利文献5)。在该报告中，以碳原子数12个 以上的脂肪酸为唯一碳源来培养豚鼠气单胞菌，发酵生产3HH组成为11~19mol %的 P(3HB-c〇-3HH)。可知：P(3HB-c〇-3HH)随着3HH组成的增加，逐渐从P(3HB)的硬且脆的性 质转而显示柔软的性质，并显示出超过P (3HB-CO-3HV)的柔软性。即，通过改变3HH的组成， P (3HB-共聚-3HH)可具有从硬质聚酯到软质聚酯的广范围的可应用物性，因此可望应用于 从诸如电视机外壳等要求硬度的产品到诸如胶片等要求柔软性的产品的广阔领域。然而、 本制造方法中，聚酯生产性低（菌体生产量4g/L、聚酯含量30% )，还不能充分地说其是面 向本聚酯的实用化的生产方法，因此，对面向实用化的可获得更高生产性的方法进行了探 索。 以P(3HB-c〇-3HH)的工业生产目标进行了一些努力。使用嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)进行培养时，在以油酸为碳源的43小时流加培养中，生产出菌体 产量为95. 7g/L、聚酯含量为45. 2%、3HH组成为17%的P(3HB-共聚-3HH)(参考非专利文 献10)。此外，以葡萄糖和月桂酸为碳源培养嗜水气单胞菌，可达到菌体产量为50g/L，聚酯 含量为50%，分子量为100万道尔顿（参考非专利文献11)。然而，嗜水气单胞菌对人体具 有病原性（参考非专利文献12)，它并不是适于工业生产的菌种。此外，这些培养生产均使 用高价格的碳源，因此从生产成本的观点出发，应该寻求利用更廉价的碳源。 因此，以安全宿主中的生产以及提高生产性为目标，进行了一些努力。从豚鼠气单 胞菌克隆了聚羟基链烷酸（PHA)合成酶基因（参照专利文献5、非专利文献9)。使用将该 基因导入真养雷氏菌（Ralstonia eutropha，旧称Alcaligenes eutropha)而得到的转化体 进行P(3HB-c〇-3HH)的生产，结果是：菌体生产性为4g/L、聚酯含量为30%。而且，使用植 物油脂作为碳源来培养该转化体，结果实现了菌体生产量4g/L、聚酯含量80% (参照非专 利文献10)。而且，对培养方法进行了研宄，通过改善培养条件，提高到菌体生产量45g/L、 聚酯含量62. 5%、3HH组成8. 1 % (专利文献6参照）。 此外，虽然已经构建了能够以果糖为碳源生产P(3HB-c〇-3HH)的Ralstonia eutropha，但该菌株的聚酯生产性低，不能说适用于实际生产（参照非专利文献11)。 还构建了以大肠杆菌为宿主的P(3HB-c〇-3HH)生产株。将气单胞菌属的PHA合成 酶基因以及Ralstonia eutropha的NADP-乙酰乙酰基Co - A还原酶基因等导入大肠杆菌 构建了菌株。以十二烷为碳源培养该大肠杆菌的结果是：生产性为40. 8小时培养时，菌体 量79g/L、聚酯含量27. 2%、3HH组成10. 8% (参照非专利文献12)。 以提高P (3HB-CO-3HH)的生产性和3HH组成控制为目标，进行了 PHA合成酶的人 工修饰。在豚鼠气单胞菌来源的PHA合成酶变体中，第149位的氨基酸即天冬酰胺被丝氨酸 取代的变体酶、第171位的天冬氨酸被甘氨酸取代的变体酶显示出在大肠杆菌内改善PHA 合成酶活性、3HH组成（非专利文献13参照）。此外，有报道称：该酶的518位的苯丙氨酸 被异亮氨酸取代的变体酶或214位的缬氨酸被甘氨酸取代的变体酶在大肠杆菌中的PHA合 成酶活性、聚酯含量有所提高（参照非专利文献14)。但是，这些方法使用特殊的大肠杆菌 作为宿主，且聚酯含量仍然低，因此，有必要灵活运用这些变体酶的特点，进行更适用于工 业生产的改良。 使用应用重组DNA技术制作的菌株、工业规模培养PHA时最重要的课题之一是导 入的基因的稳定性。基因导入可以利用使用质粒的方法、重组入宿主染色体的方法等。然 而、已知质粒会在重组菌增殖、分裂时脱落（参照专利文献7)。因此，质粒发生脱落的菌体 丧失了 PHA生产能力，从而商业生产性低下。传统上，一般的策略是：在重组菌体的培养中， 通过在培养基中添加抗生素来仅选择性地使质粒保有菌体繁殖并保持，但由抗生素的使用 带来的成本提高、由培养废液中的残留抗生素造成的环境影响等成为问题。此外，为了使质 粒稳定化，将R1质粒来源的parB基因重组到P(3HB)生产质粒中，制备了重组大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产共聚聚酯的雷氏菌属微生物，所述共聚聚酯由3‑羟基丁酸和3‑羟基己酸的单体单元构成，该微生物的染色体上本来具有聚羟基链烷酸合成酶基因，并且该聚羟基链烷酸合成酶基因的至少一部分已被取代成外源性聚羟基链烷酸合成酶基因，所述取代使得染色体上的聚羟基链烷酸合成酶基因所编码的酶的活性丧失、并且所述外源性聚羟基链烷酸合成酶基因得以表达，所述外源性聚羟基链烷酸合成酶基因编码来源于豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的酶或其变体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丸山裕之，
申请(专利权)人：株式会社钟化，梅雷迪安股份有限公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP