本发明专利技术公开了一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，可以快速检测19种皮蠹，至少包括20次用量以上的引物J1837/N2110试剂和基因条形码序列盘；引物J1837序列：5'-TATAGCATTCCCACGAATAAATA-3'，引物N2110序列：5'-ATTTCGGTCAGTTAATAATATAG-3'；所述基因条形码序列盘存有61条标准条码序列，详细序列为SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.61所示。本发明专利技术的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，是一种高效、准确、便捷的皮蠹科昆虫分子检测技术，可在分子水平将皮蠹科19种昆虫种类区分，能满足使用需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及皮蠹科昆虫检测
，具体涉及一种皮蠹科昆虫基因条形码检测 试剂盒。
技术介绍
皮蠹科昆虫广泛分布于世界各地，主要侵害储藏的动植物材料，其种群食性杂，繁 殖力强，可以忍耐环境中极低的湿度完成生活世代，造成储藏商品的数量、质量及市场价值 相当大的损失和破坏。目前皮蠹科的种类鉴定研宄仍主要集中于形态识别，传统的昆虫形 态鉴定方法存在一定的局限性，必须以完整成虫作为形态学研宄对象，近缘种、早期（卵、 幼虫和蛹）形态结构与残缺的虫体均难于鉴定。随着分子生物学研宄的起步，越来越多的 技术可以被用于皮蠹科昆虫的种类鉴定。随着科技水平的提高，近年来不少人开始利用分 子生物学手段对昆虫进行分子鉴定。分子生物学手段一般所需样品量较少，具有快速准确 等优点，可以为仓储害虫的鉴定提供可靠的参考依据。昆虫的线粒体DNA(mtDNA)是一种闭 合的双链环状遗传物质，稳定性高，大小一般为15. 4~16. 3kb，以高拷贝数目存在于线粒 体内，进化速率较核更快，且为母系遗传，在遗传过程中不发生基因重组倒位易位等突变， 这些特点使在昆虫近缘种的分类和种间鉴别等研宄中有着十分重要的意义。此外，在昆虫 新种甚至复合种的鉴定中也是非常重要的标记对象。马骏等（2009)根据斑皮蠹属序列设 计引物，分别对黑斑皮蠹、谷斑皮蠹的总mtDNACOI基因进行扩增测序，并将二者的序列进 行比对，发现二者序列的碱基差异明显，可以作为两种间的特异性标记序列，从而将黑斑皮 蠹和谷斑皮蠹成功区分开。陈岩等（2010)针对不同种皮蠹害虫线粒体基因的位点多态性， 设计了谷斑皮蠹的特异引物进行扩增，该引物可以将谷斑皮蠹的片段成功扩出，而和它外 形相似的其他种皮蠹（黑斑皮蠹、花斑皮蠹、条斑皮蠹）则没有相应的扩增条带，从而将谷 斑皮蠹与其区别开。刘聪等（2012)对黑斑皮蠹、花斑皮蠹部分mtDNACOI基因的部分序列进 行比对，针对二者序列差异，选取限制性内切酶Aflll对二者进行酶切，结果表明，黑斑皮 蠹的序列可被限制酶切开，而花斑皮蠹因不具Aflll酶酶切位点而不能被切开，从而将二 者分开。Castalanelli等（2011)还将mtDNACOI序列与18SrDNA、Cytb基因结合研宄了斑 皮蠹近缘属的系统发生关系以及谷斑皮蠹、花斑皮蠹和未知斑皮蠹等6个种的演化结构。DNA条形码技术是利用一段或几段标准的、易扩增的、种间差异显著大于种内差异 的DNA片段来鉴别物种的新技术，该概念最早由加拿大学者Hebert提出。与传统的分类鉴 定技术相比，DNA条形码技术具有许多无可比拟的优点：（1)操作简单，对物种分类鉴定知 识缺乏的人也可以通过标准技术流程对物种进行鉴定；(2)不受个体发育阶段和形态特征 的限制，只要个体存在完整的目标DNA片段即可满足鉴定需求；（3)该技术可以作为传统分 类学的辅助手段，帮助传统分类学家修正以往的分类结论，解决形态分类无法解决的难题。 正是由于DNA条形码技术具有以上及其它很多优点，越来越多的研发人员加入了DNA条形 码技术研宄行列，使该领域成为生物学研宄的热点之一（Hebert，2006)。但是关于皮蠹的基 因条码快速检测技术研宄，国内外相关的系统报道仍然不多。因此，建立准确可靠的皮蠹条 形码检测技术，不仅对我国检疫部门具有重要的意义，更是对我国基因资源的补充，特别是 皮蠹害虫资源的补充，为我国在争夺有限的资源方面能做出一定的贡献，同时也为皮蠹的 分类鉴定提供新的方法。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术提出一种皮蠹科昆虫基因条形码 检测试剂盒，实现快速高效的检测皮蠹科昆虫。 技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为： -种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，可以快速检测19种皮蠹，至少包括基因 条形码序列盘和20次用量以上的引物J1837/N2110试剂；引物J1837/N2110序列如下： J1837 序列：5' -TATAGCATTCCCACGAATAAATA-3'， N2110 序列：5'-ATTTCGGTCAGTTAATAATATAG-3' ； 所述基因条形码序列盘存有61条标准条码序列，详细序列为SEQ ID NO. 1到SEQ ID NO. 61 所示。 所述的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，还包括20次用量以上的下列试剂： Taq buffer，MgCl2, dNTP mix，Taq DNA 聚合酶，ddH20, DNA 标准样。 所述的19种皮蠹具体为：小圆皮蠹，标本圆皮蠹，地毯圆皮蠹，二星毛皮蠹，斯氏 毛皮蠹，Attagenus woodroffei，黑毛皮蠹，短角褐毛皮蠹，鼠灰皮蠹，钩纹皮蠹，拟白腹皮 蠹，火腿皮蠹，白腹皮蠹，秘鲁皮蠹，Dermestes szekessyi，赤毛皮蠹，墨西哥斑皮蠹，谷斑 皮蠹，黑斑皮蠹。 所述的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒检测皮蠹科昆虫的方法，包括以下步 骤： 1)DNA的制备：采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒 提取待检测样品； 2) PCR反应体系与反应条件 PCR 反应体系：总体积为 50yL，其中含 5yL lOXTaq buffer with KCl、2mmol/L MgCl2、200 ymol/L dNTP mix、2U Taq DNA 聚合酶、3yL DNA 模板、引物各 lymol/L; PCR反应程序：循环前94°C预变性2min ;94°C变性lmin、43°C退火温度lmin，72°C 延伸1. 5min，进行30个循环；循环结束后72°C延伸5min，-20°C保存。混合8 y L待测样品 与 2yL 6XGlycerol DNA loading Buffer 上样，以 DNA Marker DL100 为分子量标记，室 温下恒压120V，用3 %琼脂糖凝胶电泳45min，0. 5 % y mol/L的EB染色，凝胶成像系统检测 样品，拍照分析； 3)PCR结果判定混合8 y LPCR产物与 2 y L6XGlycerol DNA loading Buffer 上样，以DNA Marker DL100为分子量标记，室温下恒压120V，用3%琼脂糖凝胶电泳45min，0. 5% ymol/L的EB 染色，凝胶成像系统检测样品，拍照；照片显示皮蠹与标准DNA样品在528bp位置有清晰的 扩增条带，即为目标条带； 4) RCR产物测序获得基因序列； 5)皮蠹科昆虫基因当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，可以快速检测19种皮蠹，其特征在于：至少包括基因条形码序列盘和20次用量以上的引物J1837 /N2110试剂；引物J1837 /N2110序列如下：J1837序列：5'‑TATAGCATTCCCACGAATAAATA‑3'，N2110序列：5'‑ATTTCGGTCAGTTAATAATATAG‑3'；所述基因条形码序列盘存有61条标准条码序列，详细序列为SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.61所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑斯竹，李枷霖，詹国辉，高渊，王建斌，陈云芳，樊新华，
申请(专利权)人：苏州市外来有害生物防控技术中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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