一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法技术

本发明专利技术公开一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法。本发明专利技术利用设计的引物将血浆中包含设计SNP的DNA提取出来，经过一系列处理后上机，将测序产物比对到人类基因组序列后确定每个SNP位点的碱基。通过分析SNP中各碱基的比例来定量胎儿游离DNA浓度。本发明专利技术还可通过多个SNP来校正引入的误差，用统计学的方法对多个SNP同时计算，提高计算出的胎儿游离DNA浓度准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法
本专利技术涉及DNA定量领域，尤其涉及一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法。
技术介绍
无创产前基因检测是通过采集孕妇外周血(5ml)，提取其中的游离DNA，采用高通量测序技术，结合生物信息分析，得出胎儿患染色体非整倍体（21-三体又称唐氏综合征，18-三体，13-三体）的风险。研究发现，从孕4周开始，在孕妇外周血中即可检测到胎儿的游离DNA。随着孕周增大，胎儿游离DNA含量也随之增加。孕12周后，通过抽取孕妇外周血并从中提取出胎儿游离DNA，利用新一代基因测序技术并结合生物信息学分析手段，便可准确判断胎儿是否患有染色体病。该方法最佳检测时间为孕早、中期，具有无创取样、无流产风险、高灵敏度，准确性高的特点。无创产前基因检测技术通过分析孕妇外周血中DNA来判断胎儿是否存在染色体非整倍体，而不是针对性的分析胎儿的DNA，因此当胎儿DNA比例过低时（<3%）,可能因为胎儿DNA量太少而不能被检测出来染色体是否有异常，所以胎儿DNA的含量对检测结果的准确性和敏感性都起到了重要的作用。在一份检测结果中，如果知道胎儿DNA的比例将是对一份结果准确性的最好的复核。通过准确的定量胎儿DNA的比例，设定该DNA比例下三体所对应的阈值，对检测结果的准确性起到复核作用，同时能够避免孕周大但胎儿游离DNA浓度低造成的假阴性。虽然现在行业内都通过接收孕12周以后的孕妇来减少这种情况的发生，但孕妇个体之间的差异还是可能存在胎儿DNA比例较低（2%的孕妇会因为胎儿DNA含量低而被要求重新抽血）。现有技术通过对男胎中含有的Y染色体信息来判断男胎的浓度，对女胎还没有有效的方法。现有技术中，甲基化定量胎儿游离DNA浓度的方法被很多研究证实可以用来定量胎儿游离DNA浓度。采用该方法抽取外周血后，经DNA分离、甲基化敏感限制性内切酶消除样本中母源性(非甲基化)DNA，未分解的胎儿DNA在PCR扩增，最后定量胎儿DNA量。通过计算胎儿DNA量占外周血DNA量的比例来计算胎儿游离DNA浓度。但该方法还存在以下两个缺点：1、被确定的稳定的甲基化标志基因较少，它需要具备两个条件：1）孕妇和胎儿甲基化的差异要大，孕妇要完全不甲基化，胎儿要完全甲基化。2）甲基化差异必须保持稳定,不会因为个人之间在数量或在怀孕期不同时期存在差异。2、甲基化定量胎儿游离DNA浓度的方法是通过一个基因，因为量少的原因需要经过PCR来扩增，其中引入的误差不好被校正。另外，还有一种方法是荧光定量PCR或者绝对定量PCR法，其也被用来定量胎儿游离DNA浓度，但其有个共同的缺点就是可用的目标基因数据少，且能获得DNA量也少，很容易有偏差。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种定量孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的方法，旨在解决现有的孕妇外周血DNA定量方法准确性低、容易有偏差的问题。本专利技术的技术方案如下：一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，包括步骤：A、设计位点：在人类基因组中，找出突变频率在0.4-0.6的SNP位点；B、设计引物：根据设计的SNP位点，设计出覆盖SNP位点的SNP引物；C、提取样品DNA；D、扩增含有SNP位点的DNA片段：将样品DNA、多重PCR反应酶和SNP引物混匀后，进行PCR反应得到PCR产物；E、纯化扩增到的PCR产物；F、末端修复：将PCR产物、末端修复酶与末端修复酶缓冲液混合，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；G、片段筛选：对步骤F所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到平末端DNA片段；H、接头连接：将所得的平末端DNA片段与连接酶、连接酶缓冲液、及指定接头混合后，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；I、片段筛选：对步骤H所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到加接头的DNA片段；J、PCR扩增：对所得加接头的DNA片段进行PCR扩增及纯化，得到小片段文库；K、文库检测：对小片段文库检测浓度和片段大小；L、高通量测序：对检测合格的小片段文库进行高通量测序；M、数据预处理：将高通量测序得到的数据首先经过低质量过滤，筛选出长度大于100bp的序列；N、序列比对：将预处理后的序列与人类基因组序列进行比对；O、序列筛选：根据比对的结果，筛选出uniqueread的序列；P、SNP数据统计：根据比对结果及SNP位点的位置统计出SNP位点的覆盖深度、碱基种类、每种碱基对应数目；Q、根据统计结果，对每个SNP位点中四种碱基的出现次数进行排序，然后计算出SNP位点的覆盖深度Depth，并根据排序结果求出SNP位点的测序错误率Error；根据每行的覆盖深度Depth和测序错误率Error，求出SNP位点的平均覆盖度和测序错误率的较大值ErrorUp；根据平均覆盖度或者用户自定的覆盖深度，对SNP位点进行过滤；或根据每个SNP位点的测序错误率Error是否大于ErrorUp来过滤；R、计算每个SNP距离：对每一个SNP位点，计算出可能的胎儿游离DNA浓度Conc在四种SNP组合类型下所有SNP位点到相应胎儿游离DNA浓度的距离TypeDistance；U、计算出总距离：找出每一SNP位点在四种SNP组合类型下对应最小的TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum（TypeDistancei），i=1…N，N为SNP位点总个数；V、选择最优的总距离：在Conc范围内计算出的AllDistance中选出其中最小的，其所对应的Conc即为实际的胎儿游离DNA浓度。所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤O中，筛选出错配碱基在4个以下，且只比对到一处的序列，作为uniqueread。所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤Q中，ErrorUp=(ErrorMean+ErrorSD*2),Errormean（Errori）i=1…N，N为SNP位点个数。所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤U中，四种SNP组合类型为：类型1：母亲和胎儿都是纯合SNP；类型2：母亲纯合SNP，胎儿杂合SNP；类型3：母亲杂合SNP，胎儿纯合SNP；类型4：母亲和胎儿都是杂合SNP。所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤A中，在1-13、18及21这15条染色体上共选出1035个SNP位点。所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，Conc的范围为0.025-0.5。所述的孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其中，所述步骤R具体包括：按以下公式计算SNP距离Distance，Distance=abs(Major*A+Minor*B)/(A**2+B**2)**0.5,其中A，B是参数，具体如下：Type=1,A=Err/3,B=-(1-Err);Type=2,A=Conc/2*(1-Err)+(1-Conc/2)*Err/3,B=-((1-Conc/2)*(1-Err)+Conc/2*Err/3)；Type=3,A=(1/2-Conc/2)*(1-Err)+(1/2+Conc/2)*Err/3,B=-((1/2+Conc/2)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，包括步骤：A、设计位点：在人类基因组中，找出突变频率在0.4‑0.6的SNP位点；B、设计引物：根据设计的SNP位点，设计出覆盖SNP位点的SNP引物；C、提取样品DNA；D、扩增含有SNP位点的DNA片段：将样品DNA、多重PCR反应酶和SNP 引物混匀后，进行PCR反应得到PCR产物；E、纯化扩增到的PCR产物；F、末端修复：将PCR产物、末端修复酶与末端修复酶缓冲液混合，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；G、片段筛选：对步骤F所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到平末端DNA片段；H、接头连接：将所得的平末端DNA片段与连接酶、连接酶缓冲液、及指定接头混合后，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；I、片段筛选：对步骤H所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到加接头的DNA片段；J、PCR扩增：对所得加接头的DNA片段进行PCR 扩增及纯化，得到小片段文库；K、文库检测：对小片段文库检测浓度和片段大小；L、高通量测序：对检测合格的小片段文库进行高通量测序；M、数据预处理：将高通量测序得到的数据首先经过低质量过滤，筛选出长度大于100bp的序列；N、序列比对：将预处理后的序列与人类基因组序列进行比对；O、序列筛选：根据比对的结果，筛选出unique read的序列；P、SNP数据统计：根据比对结果及SNP位点的位置统计出SNP位点的覆盖深度、碱基种类、每种碱基对应数目；Q、根据统计结果，对每个SNP位点中四种碱基的出现次数进行排序，然后计算出SNP位点的覆盖深度Depth，并根据排序结果求出SNP位点的测序错误率Error；根据每行的覆盖深度Depth和测序错误率Error，求出SNP位点的平均覆盖度和测序错误率的较大值ErrorUp；根据平均覆盖度或者用户自定的覆盖深度，对SNP位点进行过滤；或根据每个SNP位点的测序错误率Error是否大于ErrorUp来过滤；R、计算每个SNP距离：对每一个SNP位点，计算出可能的胎儿游离DNA浓度Conc在四种SNP组合类型下所有SNP位点到相应胎儿游离DNA浓度的距离TypeDistance；U、计算出总距离：找出每一SNP位点在四种SNP组合类型下对应最小的TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum（TypeDistancei），i=1…N，N为SNP位点总个数；V、选择最优的总距离：在Conc范围内计算出的AllDistance中选出其中最小的，其所对应的Conc即为实际的胎儿游离DNA浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，其特征在于，包括步骤：A、设计位点：在人类基因组中，找出突变频率在0.4-0.6的SNP位点；B、设计引物：根据设计的SNP位点，设计出覆盖SNP位点的SNP引物；C、提取样品DNA；D、扩增含有SNP位点的DNA片段：将样品DNA、多重PCR反应酶和SNP引物混匀后，进行PCR反应得到PCR产物；E、纯化扩增到的PCR产物；F、末端修复：将PCR产物、末端修复酶与末端修复酶缓冲液混合，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；G、片段筛选：对步骤F所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到平末端DNA片段；H、接头连接：将所得的平末端DNA片段与连接酶、连接酶缓冲液、及指定接头混合后，室温下孵育进行反应得到混合DNA液；I、片段筛选：对步骤H所得混合DNA液进行片段筛选及纯化，得到加接头的DNA片段；J、PCR扩增：对所得加接头的DNA片段进行PCR扩增及纯化，得到小片段文库；K、文库检测：对小片段文库检测浓度和片段大小；L、高通量测序：对检测合格的小片段文库进行高通量测序；M、数据预处理：将高通量测序得到的数据首先经过低质量过滤，筛选出长度大于100bp的序列；N、序列比对：将预处理后的序列与人类基因组序列进行比对；O、序列筛选：根据比对的结果，筛选出uniqueread的序列；P、SNP数据统计：根据比对结果及SNP位点的位置统计出SNP位点的覆盖深度、碱基种类、每种碱基对应数目；Q、根据统计结果，对每个SNP位点中四种碱基的出现次数进行排序，然后计算出SNP位点的覆盖深度Depth，并根据排序结果求出SNP位点的测序错误率Error；根据每行的覆盖深度Depth和测序错误率Error，求出SNP位点的平均覆盖度和测序错误率的较大值ErrorUp；根据平均覆盖度或者用户自定的覆盖深度，对SNP位点进行过滤；或根据每个SNP位点的测序错误率Error是否大于ErrorUp来过滤；R、计算每个SNP距离：对每一个SNP位点，计算出可能的胎儿游离DNA浓度Conc在四种SNP组合类型下所有SNP位点到相应胎儿游离DNA浓度的距离TypeDistance；U、计算出总距离：找出每一SNP位点在四种SNP组合类型下对应最小的TypeDistance，最后求和：AllDistance=sum（TypeDistance...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈洪亮，郑海灵，祝兴强，段利朋，
申请(专利权)人：厦门万基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35