通过代谢工程生产麦角硫因制造技术

本公开的内容有关于通过体外酶促转化或使用通过代谢工程制造的微生物发酵生产麦角硫因(ergothioneine)。并揭露对此方法有用的经转化细胞(transformed cell)和以此方法生产的麦角硫因。本公开的经转化细胞比起未经转化的野生型细胞，能够以较好的效率将组氨酸和半胱氨酸或组氨酸甜菜碱(hercynine)和半胱氨酸转变成为麦角硫因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请 本申请主张于2012年12月21日所提交第61/740, 829号美国专利临时申请案的 优先权及利益。该申请的全部内容以整体引用形式并入本文。 政府资助 本专利技术在国家卫生研宄院所给予的政府资助GM093903和国家科学基金给予的国 家资助CHE-0748504下进行。美国政府对本专利技术具有一定权利。
本公开的内容通常关于通过无细胞（cell-free)酶促转化或使用由代谢工程所 制造的微生物发酵生产麦角硫因。
技术介绍
麦角硫因是由Tanret在1909年自麦角（ergot)中分离出的包含硫醇基（thiol) 的氨基酸。其独特的氧化还原特性使它成为最好的天然抗氧化剂之一。此外，由于它被许 多人类组织（如，肝、肾、中枢神经系统、和红血球）从食物中特异性富集，麦角硫因被认为 是在人类生理中具有许多好处的角色。近来，麦角硫因被广泛使用作为具有数十亿美元市 场的抗老化产品的关键成分。 麦角硫因是由两种氨基酸（组氨酸和半胱氨酸）经五个酶促步骤生产。然而，阻碍 使用目前已知通过发酵生产的麦角硫因生物合成途径的主要障碍有三个：（l)EgtE酶不能 被过度表达；(2)EgtB的活性低；（3)麦角硫因和谷胱甘肽之间对y-Glu-Cys的潜在竞争， 将限制产量。因此，目前麦角硫因是使用化学手段生产，因此该领域中仍有麦角硫因的重组 生物合成的需要。
技术实现思路
本文提供一种新颖的酶促方法以及一种代谢工程方法用以在无细胞酶促系统或 细胞培养系统中提高、增加或最大化麦角硫因的生产。该无细胞系统和使用通过本文所 揭露代谢工程所制造的基因工程微生物（engineeredmicrobial)的细胞培养系统可用 于生产较高层次的麦角硫因。本文中所述的这些过程是基于专利技术人的发现：1)在大肠杆 菌（E.coli)中成功生产EgtE和确认改善EgtB活性的条件，其使通过无细胞转化或通过 发酵以使用目前已知的麦角硫因生物合成途径来生产麦角硫因变得可能。2) -种来自该 ovothiol生物合成途径的酶（OvoA)可用于催化Cys和三甲基-组氨酸的直接氧化親合以 生产在麦角硫因生物合成中所需的关键中间产物。这样的发现是令人惊讶且意想不到的， 因为OvoA亦催化Cys和His的氧化耦合生产结构上完全不同的化合物。不希望被任何理论 所束缚，新发现的〇v〇A活性可以两个步骤缩短麦角硫因的生物合成途径且可排除麦角硫 因和glutathioneine生物合成的间的竞争。基于该新发现的OvoA化学，麦角硫因可通过无 细胞酶促系统或细胞培养系统而生产。3)另一种酶NcEgtl亦能够催化Cys和三甲基-组 氨酸的直接耦合。基于该新发现的NcEgtl化学，麦角硫因可通过无细胞酶促系统或细胞培 养系统而生产。 因此，提供于本文的某些方面是关于包括重组地表达一或多个该麦角硫因生物合 成途径的基因和一或多个ovothiol生物合成途径的基因或通过生物信息学手段识别的其 同源物（homolog)(如NcEgtl)的体外无细胞系统。另一方面涉及代谢工程生产的微生物 品系使用这些酶通过发酵以生产麦角硫因。 -些具体实施例中，该细胞重组地表达：（i)egtA基因；（ii)egtB基因；（iii)egtc 基因；（iv)egtD;以及（iv)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。一些具体实施例中，该细 胞进一步表达有SAM合成酶编码的基因。 -些具体实施例中，该细胞重组地表达：（i)ovoA基因或ncEgt-1基因或其通过生 物信息学识别的同源物；以及（ii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。 -些具体实施例中，该细胞重组地表达：（i)egtD基因；（ii)ovoA基因或ncEgt-1 基因；以及（iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。一些具体实施例中，该细胞重组地 表达：（i)egtD基因；（ii)〇V〇A基因或ncEgt-1基因：以及（iii)egtE基因和有FAD合成酶 编码的基因；以及（iv)有SAM合成酶编码的基因。 本文提供的一些方面有关于细胞培养基、无细胞酶促混合物、或将自本文中所述 的任一方面或具体实施例的发酵中收集的细胞溶解后的上清液。 本文提供的其它方面有关于一种方法，包括于本文中所述的任一方面或具体实施 例的细胞培养基中培养。 本文提供的其它方面是有关于一种方法，包括培育（incubating)自本文中所述 的细胞溶解所获得的细胞萃取物。 本文所述的各方面有关于一种方法，其包括在细胞中重组地表达该麦角硫因生物 合成途径的一或多个基因和该ovothiol生物合成途径的一或多个基因或通过生物信息学 识别的其它同源物（如NcEgtl)。 提供于本文的一些方面有关于制备麦角硫因的方法。 一些具体实施例中，该方法包括在细胞中重组地表达：（i)EgtA蛋白质或保留酶 活性的其功能性片段；（ii)EgtB蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；（iii)EgtC蛋白质 或保留酶活性的其功能性片段；（iv)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(v)EgtE 蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；以及（vi)有FAD合成酶编码的基因或保留酶活性的 其功能性片段。 一些具体实施例中，该方法包括在细胞中重组地表达：（i)ovoA或ncEgt-1基因或 通过生物信息学识别的其它同源物；以及（ii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。 一些具体实施例中，该方法包括在细胞中重组地表达：（i)egtD基因；（ii)〇V〇A基 因或ncEgt-1基因或通过生物信息学识别的其它同源物；以及（iii)egtE基因和有FAD合 成酶编码的基因。 -些具体实施例中，本文所述的方法进一步包括在细胞培养基中培养本文所述的 细胞。 -些具体实施例中，本文所述的方法包括在细胞培养基中培养本文所述的细胞， 其中该培养基以半胱氨酸、组氨酸或组氨酸甜菜碱补充。 一些具体实施例中，该细胞培养基中进一步添加一或多种铁盐。 一些具体实施例中，本文所述的方法进一步包括在溶解本文所述的细胞后，收集 细胞培养基或添加物。 -些具体实施例中，本文所述的方法进一步包括自该细胞或自该细胞生长的培养 基中回收麦角硫因。【附图说明】 本专利或申请档案中包含至少一个以彩色呈现的图式。含彩色图式的此专利或专 利申请公布的复本将在提出申请且支付必要费用后由美国专利商标局提供。 图1为针对麦角硫因和ovothiol建议的生物合成途径的示意图示。 图2为根据本文所述的具体实施方法生产麦角硫因的示意图示。途径A凭借EgtE 的成功生产和EgtB活性的改善；途径B凭借该些酶（如，OvoA和NcEgtl)具有2至4转变 的能力的发现和EgtE的成功生产。 图3显示两种不同的针对EgtB和OvoA催化作用的试验。 图4显示EgtE的纯化样品的SDS-PAGE和UV-VIS数据；图4A显示分子量标记（M 道）、上清液（SN道）、细胞沉淀（cellpellet) (CP道）、流通（flowthrough) (FT道）、洗脱 级分（elutionfractions)l和 2(分别为El和E2 道）、和洗绦级分（washfractions)l、2、 和3 (分别为W1，1、W2，1、和W3，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备麦角硫因的过程，该过程包括：(i)以包括重组地表达：(a)EgtA蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(b)EgtB蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(c)EgtC蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(d)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、和(e)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段的反应混合物培育组氨酸或组氨酸甜菜碱；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘平华，宋恒，胡文，
申请(专利权)人：刘平华，宋恒，胡文，
类型：发明
国别省市：美国;US