一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，它包括如下步骤：(a)取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度是80-150mL/min，灌注的时间是5-12小时；(b)灭菌，即可。本发明专利技术还提供了上述方法制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。本发明专利技术制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架抗凝血性能强、细胞相容性好，对种植于其上的细胞的生存、分化和增殖等起到了极为重要的支撑作用，为构建具有临床应用价值的异源性组织工程化生物抗凝支架提供了一种方便廉价的来源和制备方法。

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架及其制备方法
本专利技术属于临床医学、生物医学与再生医学领域，具体涉及一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架及其制备方法。
技术介绍
肝脏是人体十分重要的器官，被誉为人体的“解毒工厂、代谢化工厂”，但当其受到病毒、酒精、药物等多种因素严重侵害时，会造成肝细胞大量坏死，导致肝脏功能衰竭。迄今为止，受到供体器官短缺、手术过程繁复等特征制约的肝脏移植是临床上唯一有效的根治肝脏功能衰竭的方法。组织工程肝脏作为肝脏移植的潜在替代治疗手段，正在逐渐受到重视。其中，肝脏支架材料的质量是制备组织工程肝脏的核心要素之一。去细胞化肝脏生物支架，具有与原肝脏相同的基质成分(如胶原、纤连蛋白、弹力蛋白等)和三维立体微结构，同时含有丰富的细胞因子和生长因子，是一种优秀的天然生物支架材料，与人工合成材料相比具有明显优势，是构建具有临床应用前景的理想肝脏支架材料来源。目前制备去细胞化肝脏生物支架的文献，大多是灌注肝脏直接去细胞化即可，以获得完整的细胞外支架网络。然而，单纯去细胞化的去细胞化肝脏生物支架血液相容性较差，在临床治疗中容易形成血栓。通过对去细胞化肝脏支架进行灌注抗凝修饰，可以提高去细胞化肝脏生物支架的血液相容性，但是由于去细胞化肝脏支架的三维结构和血管网络非常复杂，要制备得到的抗凝能力强、支架各个部分抗凝效果均一、而且抗凝时间长的去细胞化支架材料非常难，已有的修饰方法复杂、制备成本高，而且抗凝血效果还不理想。如，公开号为101850136的专利申请公开了层层自组装修饰猪肝去细胞化支架材料，以提高抗凝性能的方法，但是其需要用两种溶液和一种洗涤液分别交替灌注八次，在交替灌注过程中容易在灌注液中混入气泡，特别是对于大器官(如猪肝，猪肾)在高流速灌注时，溶液交替过程中很容易混入气泡，导致灌注修饰过程失败；同时，修饰后肝素含量最多只能达到12μg/mg组织干重，抗凝效果不佳，且修饰后肝素与材料是依靠静电力结合，结合不够牢固，释放速度快，24小时释放量达到50％以上，无法长期抗凝。另外，Chen-ChiTsaietal.“Effectsofheparinimmobilizationonthesurfacecharacteristicsofabiologicaltissue"fixedwithanaturallyoccurringcrosslinkingagent(genipin):aninvitrostudy”，Biomaterials22(2001)523-533、孙赳等，“肝素末端结合修饰猪肝去细胞化支架材料的抗凝性能研究”生物医学工程与临床2014年5月第18卷第3期、吴琼等“肝素层层自组装修饰猪肝去细胞化支架材料的抗凝血性能研究”，北京：中国科技论文在线，2014-3-19等许多文献均提供了对肝脏切片进行肝素化修饰的方法，具体是将肝脏切片浸泡在肝素溶液中进行修饰，但是由于去细胞化肝脏支架的三维结构和血管网络非常复杂，简单浸泡根本无法达到目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备过程简单、成本低廉的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架及其制备方法。本专利技术提供了一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，它包括如下步骤：(a)取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度是80-150mL/min，灌注的时间是5-12小时；(b)灭菌，即可。去细胞化肝脏生物支架，是通过去细胞化技术建立的完整保留肝脏三维结构和脉管系统的肝脏生物支架。优选地，步骤a)中，所述去细胞化肝脏生物支架是用1％TritonX-100溶液和1％SDS溶液去细胞化处理得到的去细胞化肝脏生物支架。进一步优选地，所述去细胞化肝脏生物支架按照如下方法制备：取离体肝脏，用1％的TritonX-100溶液以200mL/min流速灌注3h，再用1％SDS溶液以200mL/min流速灌注6h，最后用1％TritonX-100溶液和去离子水灌洗去除残留SDS，获得去细胞化猪肝脏生物支架。优选地，步骤(a)中，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度为1-3.3g/L。进一步优选地，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度为3.3g/L。优选地，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中还含有亚硝酸钠、NaBH3CN和NaCl，它们的浓度依次为亚硝酸钠33mg/L、NaBH3CN10mg/L、NaCl0.15mol/L。NaBH3CN：氰基硼氢化钠。优选地，步骤(a)中，所述灌注为循环灌注。循环灌注：是从肝门静脉灌流进入的灌流液从肝上下腔流出后，又继续从肝门静脉灌流进入，循环使用。优选地，步骤(a)中，所述灌注的速度为100mL/min，灌注的时间为5-8小时。进一步优选地，所述灌注的速度为100mL/min，灌注的时间为6小时。优选地，步骤(a)中，灌注时，环境温度为室温。室温：指15～25℃。优选地，步骤(b)中，所述灭菌采用含有抗生素的PBS溶液灌注，所述抗生素为青霉素/链霉素、氟康唑或甲硝唑。其中，所述灌注的速度为100-300mL/min，灌注的时间为6-24小时。优选地，所述灌注的速度为200mL/min，灌注的时间为6小时。所述含有抗生素的PBS溶液是含有青霉素/链霉素的PBS溶液，其中，青霉素的终效价为100U/mL，链霉素的终浓度为100μg/mL。本专利技术还提供了前述任意一项方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。本专利技术方法制备简便、成本低廉，不仅可以用于猪肝脏，而且可以适用于各种与猪肝脏规格相近的大型动物肝脏，如人、猴、狗的肝脏，具有应用的广泛性。本专利技术提供的制备具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的方法，抗凝修饰过程中只使用一种灌流液，修饰过程的操作简化，无交替灌流过程，避免了在气泡问题；修饰后肝素含量高，最高能达到20μg/mg组织干重；修饰后去细胞化肝脏生物支架表面均匀肝素化，支架各个部分的抗凝作用均一；并且末端修饰后，肝素与材料是形成共价结合，结合牢固，释放速度缓慢，24小时释放量仅为20％左右，利于长期抗凝。本专利技术方法制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，保持了去细胞化肝脏生物支架上特定的微结构，具有抗凝血性能强、免疫原性低等特点，对种植于其上的细胞的生存、分化和增殖等起到了极为重要的支撑作用，能够用于体内组织重建，为构建具有临床应用价值的异源性组织工程化生物抗凝支架提供了一种方便廉价的来源。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1未去细胞化猪肝(图1A)和去细胞化猪肝支架(图1B)的HE染色结果。图2未去细胞化猪肝(1、3、5、7、9和11泳道)和去细胞化猪肝支架(2、4、6、8、10和12泳道)样品DNA经过聚合酶链式反应扩增出的猪特异性DNA片段电泳结果。图3未修饰的去细胞化猪肝支架(图3A)和经过肝素化全肝修饰的去细胞化支架(图3C)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：(a)取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度是80‑150mL/min，灌注的时间是5‑12小时；(b)灭菌，即可。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，其特征在于：它由如下步骤制备：（a）取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度是80-150mL/min，灌注的时间是5-12小时；（b）灭菌，即可；步骤（a）中，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度为1-3.3g/L；所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中还含有亚硝酸钠、NaBH3CN和NaCl，它们的浓度依次为亚硝酸钠33mg/L、NaBH3CN10mg/L、NaCl0.15mol/L；步骤（b）中，所述灭菌采用含有抗生素的PBS溶液灌注，所述抗生素为青霉素/链霉素。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a）中，所述去细胞化肝脏生物支架是用1%TritonX-100溶液和1%SDS溶液去细胞化处理得到的去细胞化肝脏生物支架。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述去细胞化肝脏生物支架按照如下方法制备：取猪离体肝脏，用1%的TritonX-100溶液以200mL/min流速灌注3h，再用1%SDS溶液以200mL/min流速灌注6h，最后用1%TritonX-100溶液和去离子水灌洗去除残留SD...

【专利技术属性】
技术研发人员：包骥，步宏，王宇嘉，吴琼，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51