红花MYB12基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一个红花MYB基因，具有转录调控基因表达特性，通过转录调节黄酮代谢相关基因的表达，能够提高红花中总黄酮的含量，为培育高黄酮含量新品系奠定了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物工程领域，具体涉及红花的MYB12基因及其在培育高黄酮含量的转 基因植物中的应用。
技术介绍
mCarthamustinctoriush.、%一年生草本植物，为菊科、红花属植物。红花 黄色素（safflor yellow)作为其主要有效成分，是从其干燥管状花中分离的水溶性查尔酮 的混合物，具有活血化瘀，通脉止痛等功效，被广泛应用在冠心病、高血压、脑梗塞、抗肿瘤、 糖尿病并发症、慢性肾病等疾病上。可见，红花黄色素是一种极具潜力的天然药物。虽然红 花的种植面积在我国不断扩大，但仍未能解决红花黄色素资源匮乏问题。提高红花自身黄 色素含量，培育高产黄色素的红花新品系，具有重要经济意义。 红花黄色素属于植物次生代谢产物黄酮类化合物。在植物次生代谢中，黄酮类的 生物合成是目前研宄最为深入的次生代谢途径。植物黄酮类生物合成途径主要由两类基因 控制：结构基因和调苄基因。其中，结构基因直接编码与黄酮类次生代谢生物合成有关的 各种酶类，而调苄基因则是控制结构基因表达强度和表达方式的一类基因，包括MYB、NAC、 WARY等。目前，与黄酮类生物合成的主要结构基因和调苄基因在多种植物中被克隆。尽管 已有学者利用转基因技术，将控制黄酮类次生代谢的关键酶基因或其反义序列导入植物， 通过促进或抑制该基因的表达，改变了黄酮类次生代谢途径，然而植物类黄酮生物合成途 径是非常复杂的，涉及到的酶种类繁多，有时并不是一两个关键酶所能控制。这种方法不能 诱导整个代谢通路表达，只可以获得某一产物表达量的增高，但这远远达不到实际应用的 需求，而通过转录因子作用，可以直接激活整个代谢通路，有可能激活类黄酮次生代谢途径 中多个结构基因的表达，达到的效果将比导入某个结构基因的作用更明显。 MYB蛋白作为调控因子，参与黄酮类化合物生物合成并发挥重要的作用，是目前植 物黄酮类化合物代谢分子生物学领域研宄的热点之一。其中的R2R3类MYB蛋白在植物花 色形成以及类黄酮代谢的调控起到重要的作用。Sitakanta Pattanaik等在烟草中分离到 了一个R2R3类的MYB基因NtAN2,它是在花瓣中特异表达的。NtAN2基因在烟草和拟南芥 中表达后，类黄酮代谢途径中的上下游相关基因都上调表达，而在烟草中用RNAi技术抑制 NtAN2的表达后，得到的是开白花的烟草，类黄酮代谢途径中下游基因的表达都受到了抑 制。然而，有关调控黄酮代谢的红花MYB的研宄还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为提高植物中黄酮化合物含量，而提供一种红花MYB基因。 红花MYB基因，其碱基序列如核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。 红花MYB基因，它是将塔城红花花瓣中的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用 引物： CtMYB12-l ：ATGAAGGAGCGTCAACG CtMYB12-2 ：TTAACTCAACCCATGATGATG 进行PCR扩增获得。 -种表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO. 1所示的基 因； 所述的植物表达载体为pBASTA。 红花MYB基因在培育高黄酮含量的转基因植物中的应用； 所述的植物为红花或拟南芥。 本专利技术提供了一个红花MYB基因，具有转录调控基因表达特性，通过转录调节黄 酮代谢相关基因的表达，能够提高红花中总黄酮的含量，为培育高黄酮含量新品系奠定了 坚实的基础。【附图说明】 图1通过RT-PCR扩增出798bp的含有起始密码子的片段（图1A)，回收后的片段连 接到pEASY-Tl上，进一步通过菌液PCR (图1B)和沉况1和班III酶切鉴定（图1C); 图 2 为 3' RACE ; 图3红花MYB全长基因电泳图； 图4 pBASTA载体图谱； 图5 MYB12基因的原核表达电泳图； 图 6 pBASTA-MYB12 菌液 PCR 验证； 图7 pBASTA-MYB12重组子酶切验证； 图8转基因拟南芥中黄酮含量测定。【具体实施方式】 实施例1红花（toritts L )花辦RNA提取及cDNA合成 用TRIZOL Plus提取塔城红花花瓣RNA，取1 y g总RNA反转录为cDNA模板。 实施例2 MYB基因的序列片段的验证 根据本实验室红花454测序结果中挑选的候选基因，设计特异性引物(表1)，验证基因 片段。根据验证的MYB的基因片段，设计引物(表1)进行基因片段克隆。根据红花454测序 结果拼接比对，获得了 MYB基因的序列片段，通过RT-PCR扩增出798bp的含有起始密码子 的片段（图1A)，RT-PCR反应体系见表2。回收后的片段连接到pEASY-Tl(北京全式金生 物技术有限公司）上，进一步通过菌液PCR (图1B)和沉况I和"i/?d III酶切鉴定（图1C)， 测序结果正确。【主权项】1.红花MYB基因，其碱基序列如核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。2.红花MYB基因，它是将塔城红花花瓣中的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用 引物： CtMYB12-1 ：ATGAAGGAGCGTCAACG CtMYB12-2 ：TTAACTCAACCCATGATGATG 进行PCR扩增获得。3. -种表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID NO. 1所示的基因。4. 根据权利要求3所述的一种表达载体，所述的植物表达载体为pBASTA。5.红花MYB基因在培育高黄酮含量的转基因植物中的应用。6. 权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的植物为红花或拟南芥。【专利摘要】本专利技术公开了一个红花MYB基因，具有转录调控基因表达特性，通过转录调节黄酮代谢相关基因的表达，能够提高红花中总黄酮的含量，为培育高黄酮含量新品系奠定了坚实的基础。【IPC分类】A01H5-00, C12N15-29, C12N15-82【公开号】CN104845978【申请号】CN201510255199【专利技术人】官丽莉, 李海燕, 李校堃, 杨晶, 杜林娜, 王法微, 董园园 【申请人】吉林农业大学【公开日】2015年8月19日【申请日】2015年5月19日本文档来自技高网...

【技术保护点】
红花MYB基因，其碱基序列如核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：官丽莉，李海燕，李校堃，杨晶，杜林娜，王法微，董园园，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22