本发明专利技术涉及甘蓝型油菜SKIP(BnSKIP)基因家族及其重组载体和应用，BnSKIP基因家族包括BnSKIP-1基因和BnSKIP-2基因两个成员，BnSKIP-1全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示，基因组DNA如SEQ ID No.12所示；BnSKIP-2全长cDNA序列如SEQ ID No.15所示，基因组DNA如SEQ ID No.13所示；将BnSKIP-1基因和BnSKIP-2基因构建超量表达载体，转化甘蓝型油菜品种中油821后，获得转基因植株；与非转基因对照相比，转基因植株在干旱胁迫条件下的抗性显著提高，为通过基因工程手段改良油菜抗逆性提供了重要的基因资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及甘蓝型油菜SKIP (BnSKIP)基因家族，还涉及 含有BnSKIP基因家族的重组载体和BnSKIP基因家族的应用。
技术介绍
干旱对农业生产有极其严重的影响，是造成全世界作物减产最主要的自然逆境因 素，其危害相当于其它自然灾害之和。我国是一个水资源贫乏的国家，人均水资源占有量不 及世界人均水平的1/4,是全球13个人均水资源最贫乏的国家之一。近60年来，我国年均 受旱面积2157万公顷，成灾面积956万公顷，占总气象灾害受灾面积的55%。尤其是2000 年以来，因旱成灾面积大幅度增加，全国年均因旱粮食损失达到3728万吨，占粮食总产的 7. 7%，严重威胁着我国的粮食安全。 油菜（Brassica napus)是世界上主要的油料作物之一。目前，我国常年种植面积 约733万公顷，总产1200万吨，播种面积和总产量均居世界首位。作为我国传统的食用油， 2009年菜籽油已占国产油料作物产油的57 %以上，成为国产食用植物油的第一大来源。近 年，随着人民生活水平的提高，人们对植物油的需求与日俱增，但由于油菜比价效益降低， 种植面积迅速下降，导致国内食用植物油自给率低于40%，成为我国大宗农产品中对国际 市场依存度最大最严峻的作物。长江流域是我国油菜主产区，虽然降雨充沛，但全年降水不 均，季节性干旱频繁发生，长江中游油菜主产区常常受到秋冬旱危害，而长江上游产区则主 要受春旱的危害。例如2011年，长江中下游地区遭受50年一遇的罕见高温干旱灾害，导 致油菜单产和总产量均显著下降。干旱已成为限制我国油菜生产和发展的重要障碍因素之 一。发生旱灾时，油菜出苗不齐、栽后出叶缓慢、绿叶面积减小、生长缓慢、植株矮小，严重影 响产量，区域总产减少可达25% -32%。严重干旱还会影响营养元素的正常吸收，加重油菜 缺硼的发生程度和范围，导致油菜花而不实。因此，系统研宄油菜耐旱的生理、遗传和分子 机理，挖掘油菜自身的基因潜力，利用基因工程技术提高油菜的抗旱能力，培育抗旱油菜新 品种，对保障我国食用油供给安全，实现农业的可持续发展具有深远的理论意义与应用价 值。 同为十字花科的模式植物拟南芥功能基因组学的研宄成果，为推动甘蓝型油菜重 要性状的分子机理研宄和比较基因组学研宄提供了重要参考。通过对拟南芥盐敏感突变体 Atskip的研宄发现AtSKIP基因在植株适应干旱、盐害和其他非生物胁迫中具有重要作用。 作为细胞周期信号途径的调节因子，AtSKIP可参与拟南芥根和叶片细胞周期调节的生长和 发育。AtSKIP能与剪接复合体中的剪接因子富含丝氨酸和精氨酸蛋白45(Ser/Arg-rich protein45, SR45)互作，并能通过调节时间节律相关基因PSEUDORESPONSE RE⑶LAT0R 7 (PRR7)和PRR9等的可变剪接方式实现对植物生物钟的精确调控。但是，目前甘蓝型油菜 SKIP基因的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性、与抗旱性的关系和在基因工 程中的应用等都未见报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供甘蓝型油菜SKIP (BnSKIP)基因家族。 为达到上述目的，本专利技术采用cDNA末端快速扩增（RACE)技术，克隆了甘蓝型油菜 SKIP基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进行了系统的生物信息学分析和 功能比较基因组学研宄。结果显示： 所述甘蓝型油菜SKIP基因家族包括以下2个成员：BnSKIP-l基因和BnSKIP-2基 因；所述BnSKIP-1基因如SEQ ID No. 12所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No. 14所示；所 述BnSKIP-2基因如SEQ ID No. 13所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No. 15所示。 甘蓝型油菜SKIP基因家族2个成员间具有较高的同源性，基因组序列一致率为 92. 6%，编码区序列一致性为97. 1%，编码蛋白水平的一致性为98. 4%。甘蓝型油菜SKIP 基因家族成员BnSKIP-1和BnSKIP-2与拟南芥SKIP(AtSKIP)基因间基因组序列一致率为 76. 7%和75. 8%，编码区序列一致率为83. 1 %和82. 9%，编码蛋白水平的一致率为86. 0% 和86. 7%，其中在SNW/SKIP结构域的一致性达到94. 6%和95. 2%。核酸水平的序列比对、 系统发生聚类、特征性变异碱基、特征性变异氨基酸等方面都表明，甘蓝型油菜SKIP基因 家族2个成员都是AtSKIP基因的垂直同源基因，具有相似的结构特征。 定量RT-PCR检测表明，甘蓝型油菜SKIP基因家族2个成员总体表达是相似的，也 与拟南芥SKIP大体相似。BnSKIP基因家族及成员BnSKIP-1在5?种子中的表达量最高， 其次是花，接着是1?种子、蕾、叶、30D种子、4?种子、根、荚果皮、下胚轴、莖，在子叶中表 达量最低。成员BnSKIP-2在5?种子中的表达量最高，其次是花，但其表达量均比BnSKIP 基因家族及成员BnSKIP-1稍低，而在下胚轴和子叶中的表达量却比BnSKIP基因家族及成 员BnSKIP-1稍高，具体表达量高低依次为下胚轴、1?种子、30D种子、子叶、叶、4?种子、 蕾、根、荚果皮、茎。 甘蓝型油菜SKIP基因家族总体及分成员逆境响应和激素诱导表达模式分析表 明31^1(1?基因家族的总体表达受？￡6(10%)、甘露醇（5〇1^)、高温、似(：1(25〇1111)和脱落 酸（0.1 mM ABA)处理诱导表达上调，成员间对不同处理的响应不完全一致。水杨酸（5mM SA) 处理对BnSKIP-2无诱导作用，但使BnSKIP-1显著上调5倍左右。这些结果均表明BnSKIP 基因家族受多种逆境胁迫诱导，在甘蓝型油菜抗旱分子机制中具有重要作用。 本专利技术的目的之二在于提供含有甘蓝型油菜SKIP基因家族或BnSKIP基因家族截 短片段的重组表达载体。 为实现上述目的利用本专利技术的BnSKIP基因家族中的任一种或多种基因或基因截 短片段，可以构建BnSKIP基因重组表达载体，用于SKIP基因的超量表达、反义抑制、RNA干 扰和CRISP/CAS9基因编辑等。优选的，所述重组表达载体含有SEQ ID No. 14所示第1~ 2168位和SEQ ID No. 15所示第1-2214位的核苷酸序列。更优选的，所述重组表达载体是在 PCAMBIA2301M1B载体的35S启动子和N0S终止子之间连入SEQ ID No. 14所示第1~2168 位和SEQ ID No. 15所示第1-2214位的核苷酸序列；所述PCAMBIA2301M1B载体由以下方法 制备：用EcoRI和Hindlll限制性内切酶切下pBI121载体的⑶S表达盒，连入pCAMBIA2301 的 EcoRI 和 Hindlll 之间，得 pCAMBIA230G ;然后用 SEQ ID N0. 24 和 SEQ ID N0. 25 所述序 列扩增PFGC5941载体的BASTA表达盒，经Hindlll酶后正向连入pCAMBIA230G的Hindlll 酶位点处，PCAMBIA2301M1B载体。 本专利技术的目的之三在本文档来自技高网...
【技术保护点】
甘蓝型油菜SKIP基因家族，其特征在于：所述甘蓝型油菜BnSKIP基因家族包括BnSKIP‑1基因和BnSKIP‑2基因两个成员，所述BnSKIP‑1全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示；所述BnSKIP‑2全长cDNA序列如SEQ ID No.15所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢坤，李加纳，张凯，曲存民，梁颖，唐章林，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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