一种肠道病毒多重RT-PCR试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、5xRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、随机引物、三对特异性引物、多重10xPCR Buffer、Taq酶；本试剂盒依据肠道病毒基因保守序列5’端非编码区设计通用引物：F1：5’-ACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’，F2：5’-GATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’；依据EV71病毒VP1基因保守序列设计引物；依据CA16病毒VP1基因保守序列设计引物。本发明专利技术测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中的PCR试剂盒，尤其涉及一种肠道病毒多重RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction，反车专录酶 _ 聚合酶链锁反应)i式齐lj 盒。
技术介绍
手足口病（Hand，foot and mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的传染病， 多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱瘆，少数患儿可引起心肌炎、肺水 月中、无菌性脑膜脑炎等并发症，个别重症患儿如果病情发展快，导致死亡。引发手足口病的 肠道病毒有20多种（型），柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病 毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A 16型（Cox A16)和肠道病毒 71型（EV 71)最为常见。 我国自1981年在上海始见本病，往后湖北、广东等十几个省市均有报道手足口病 例的报道。1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发流行，5~10月间发生了 7000余 病例，经过2年散发流行后，1986年又出现暴发，在托儿所和幼儿园2次暴发的发病率分别 达2. 3%和1.9%。1995年武汉病毒研宄所从手足口病人中分离出EV 71病毒，1998年EV 71感染在我国台湾省引发大量手足口病和疱瘆性咽峡炎，在6月和10月两波流行中，共监 测到129 106病例，重症病人405例，死亡78例，大多为5岁以下的儿童，并发症包括脑炎、 无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血。近几年，在大陆内地以及亚洲一些其他国家地区，如越南、 马来西亚等国家，手足口病又一次大爆发，保守估计有病例几万余例，死亡率达到几百甚至 上千例，所以此时迫切的需要一种快速准确的检测方法来检测肠道病毒，以助于流行病学 调查和医院系统对儿童病情的快速诊治。 直到最近，从儿童咽拭子和排泄物样品中分离肠道病毒，再利用特异性的抗原检 测方法来对分离的病毒进行血清型的鉴定是现今对肠道病毒的一种主要诊断方法。如今， PCR技术日渐成熟，足可以代替以前鉴定肠道病毒的检测方法，如多重RT-PCR技术，能及时 迅速准确检测出多种肠道病毒，如EV71和CA16等，在大量临床样本检测中拥有快速准确高 效的特性，具有巨大的市场潜能。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种肠道病毒多重 RT-PCR试剂盒。 本专利技术的目的是这样实现的： 肠道病毒多重RT-PCR试剂盒(简称试剂盒） 本试剂盒是在对肠道病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异 性引物，利用PCR技术对肠道病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也 降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。 在按下述方法设计的引物存在下，在PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现 对肠道病毒的检测。 具体地说，本试剂盒包括M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、5xRT-PCR Buffer、阳性 对照、阴性对照、随机引物、三对特异性引物、多重lOxPCR Buffer、Taq酶； ① 依据肠道病毒基因保守序列5'端非编码区设计通用引物： F1 :5' -ACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3' 22bp， F2 :5' -GATTGTCACCATAAGCAGCCA-3' 21bp ； 依据EV71病毒VP1基因保守序列设计引物： EV71F :5 ' -AGARAGYTCTATAGGRGAYAG-3 ' 2lbp， EV71R :5' -GGAGGGAGRTCTATCTCYCC-3' 20bp ； 依据CA16病毒VP1基因保守序列设计引物： CA16F :5' -AAGGGTAATGGARTGTGGTGAY-3' 22bp， CA16R :5' -GTGTGTGTTGAACCATCACTC-3' 21bp ； 其中：R=A或G，Y=C或T ; ② 阳性对照： 连接有设计肠道病毒、EV71、CA16引物的基因保守序列的pGBKT-7克隆载体； ③ 阴性对照： RNase Free H20 ； ④ 5 X RT-PCR Buf f er 配制： Tris-HCl 250mM KC1 375mM MgCl2 15mM DTT 50mM dNTP lOmM 配置混合后于冰箱_20°C保存； ⑤ 多重10 XPCR Buffer配制： Tris-HCl lOOmM KC1 500mM MgCl2 25mM dNTP 2mM Nonidet P40 0. 8% 配置混合后于冰箱_20°C保存。 试剂盒的使用方法 ①病毒核酸的提取： A、 首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇； 在漂洗液中加入30 μg/ml carrier RNA; B、 取30 y 1蛋白酶放入1. 5ml离心管中； C、 将标本(如咽拭子等）取200 y 1加入此管中，充分混匀； D、 再在每管分别加入200 y 1漂洗液(含30 y g/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70°C 温育lOmin ; E、 加入250 y 1无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min ; F、 将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心lmin，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回 收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液； G、 滤柱中加入500 y 1缓冲液1，12000rpm，离心lmin，弃收集管中的离心液； H、 另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入 500 y 1缓冲液2,12000rpm，离心lmin，重复步骤⑧一次； I、 将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37°C 15min 以干燥滤膜； J、 将滤柱放在1. 5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase_free H20,室温静置 2min。12 OOOrpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。 ②逆转录PCR扩增(每份50ul体系） 取30ul提取的核酸作为RT-PCR反应模板，同时加入20ul RT-PCR反应液至PCR管中 进行RT-PCR扩增。 a) RT-PCR反应液的配制： 5XRT-PCR Buffer 10ul RNA 酶抑制剂（25U/ul) lul M-MLV 逆转录酶（200U/ul) 2ul 随机引物 lul RNase Free H20 6ul 反应液体积： 20 ul b) RT-PCR反应程序： X 37 °C 60min 1 70 °C lOmin S End c) 检测 本专利技术使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR仪进行检测。 d)结果 RT-PCR后得到病毒核酸的cDNA片段。 ③多重PCR扩增(每份25ul体系） 取5ul反转录成的cDNA作为模板，同时加入20ul PCR反应液至PCR管中进行多重PCR 扩增。 a)多重PCR反应液的配制： 多重 lOxPCR Buffer 13ul EV71F/R (20mM) 各 0?5 ul CA16F/R (20mM) 各 0?5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肠道病毒多重RT‑PCR试剂盒，其特征在于：本试剂盒包括M‑MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、5xRT‑PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、随机引物、三对特异性引物、多重10xPCR Buffer、Taq酶；依据肠道病毒基因保守序列5’端非编码区设计通用引物：F1：5’‑ACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG‑3’ 22bp， F2：5’‑GATTGTCACCATAAGCAGCCA‑3’ 21bp； 依据EV71病毒VP1基因保守序列设计引物： EV71F：5’‑AGARAGYTCTATAGGRGAYAG‑3’ 21bp， EV71R：5’‑GGAGGGAGRTCTATCTCYCC‑3’ 20bp； 依据CA16病毒VP1基因保守序列设计引物： CA16F：5’‑AAGGGTAATGGARTGTGGTGAY‑3’ 22bp， CA16R：5’‑GTGTGTGTTGAACCATCACTC‑3’ 21bp； 其中：R=A或G，Y=C或T；阳性对照：连接有设计肠道病毒、EV71、CA16引物的基因保守序列的pGBKT‑7克隆载体；③阴性对照：RNase Free H2O；④5×RT‑PCR Buffer配制： Tris‑HCl 250mM KCl 375mM MgCl2 15mM DTT 50mM dNTP 10mM 配置混合后于冰箱‑20℃保存；⑤多重10×PCR Buffer配制： Tris‑HCl 100mM KCl 500mM MgCl2 25mM dNTP 2mM Nonidet P40 0.8％ 配置混合后于冰箱‑20℃保存。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘为勇，王涛，
申请(专利权)人：湖北创瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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