本发明专利技术涉及一种以NHS活化的sephrose4FF为载体，赭曲霉毒素A特异性适体为配基制备的具有操作简单，偶联速度快，偶联效率高的适体亲和柱的制备方法。经系统考察后，该亲和柱在中药中适用性良好，能起到快速净化中药中赭曲霉毒素A的目的，且所建立的检测方法准确度好，灵敏度高，可用于中药中赭曲霉毒素A的快速筛查。此外，该适体亲和柱制备方法简便易行，生产成本较低，质量稳定可控，能满足中药中赭曲霉毒素A的快速检测，具有广阔的开发前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种中药中赭曲霉毒素 A的净化新方法，特别是涉及适体亲和柱 (AAC)的制备，AAC净化超高效液相荧光检测及液质联用检测中药中赭曲霉毒素 A，其属于 真菌毒素检测领域。
技术介绍
赭曲霉毒素 A(ochratoxinA，0ΤΑ)是异香豆素联结L-苯丙氨酸的衍生物，由曲霉 菌属和青霉菌属等产毒菌株产生的二级代谢产物，具有很强的肝肾毒性、神经毒性及免疫 毒性等，故1993年国际癌症组织IARC已将其定义为2B类致癌物。OTA在全球污染范围较 广，其广泛存在于各类食品及农作物中，且污染水平较高。近年来，一些诸如甘草、生姜、姜 黄等中草药及其制品也被发现污染0ΤΑ，且污染状况不容小觑。但由于中药材种类繁多、基 质复杂、加工和储藏尚存在不当之处加之OTA痕量（ppb)、pH敏感性等特点，实际检测困难 重重。故目前除了欧盟（EU)对甘草和芳香植物做了相关的OTA限量规定外，其他国家尚 处于摸索阶段，特别是我国相关组织对中药材OTA的限量还是空白。因而寻找一种简单、 快速、准确、经济、特异性的前处理方法，消除中药基质干扰，对于研究中药中OTA的污染状 况，制定中药中OTA的限量标准具有重要意义。 适体（aptamer)是通过指数富集配基系统进化技术（SELEX)体外筛选得到的一类 与目标分子高特异性结合的寡聚核苷酸片段。作为靶物质识别元件，与抗体相比aptamer 具有多重优势，如其合成往往可通过体外化学合成，而抗体则需在一定的生理条件下，故 aptamer受环境的影响较小，易于修饰，且制备更为经济，此外aptamer对结构类似物的识 别能力更强，可达到nM级别，而抗体往往存在交叉反应。因此其作为一个优于抗体的新型 识别配基，已在食品快速检验、环境检测、临床诊断和治疗以及毒理研究等领域展示了良好 的应用前景。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种制备方法简单、偶联速度快、偶联效率高、净化效果好可有 效排除中药基质的干扰的AAC的制备方法，其优点在于以适体为特异性配基，NHS活化的 sepharose4FF为载体，将这两者的优势联合起来，起到高效偶联，快速净化的目的，操作简 单，价格低廉，能够应用于不同中药部位，消除不同中药成分的干扰，具有广阔的开发前景。 技术解决方案 本专利技术采用的技术方案是：优选、合成和末端修饰OTA适体序列，再在一定条件下 混合NHS活化的 sephr〇Se4FF，偶联上适体，制备出AAC ;再以易污染真菌毒素的不同中药 部位，不同次生代谢产物考察对柱效的影响；最后联合使用UPLC-FLR，UFLC-MS / MS等分析 仪器建立AAC净化中药中OTA的检测方法。 技术路线图见图1 技术要点： (I) AAC的制备方法，按照下述步骤进行： a. OTA适体序列的筛选：查阅文献，合成相关适体DNA序列，考察不同序列的特异 性，Apt-2对黄曲霉毒素 B1, B2的吸附性较好，对黄曲霉毒素 G1, G2及OTA也有一定的吸附， 故特异性不强，因此优先OTA特异性序列为Apt-I (5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGG-AGCAT CGGACA-3'），选择合适的末端修饰方法-5'端C6间隔臂氨基修饰； OTA适体特异性图见图2 b.AAC的制备：主要包括适体复性，洗涤，偶联，封闭，洗涤，装柱。考察载体不同活 化方式（CNBr、Expoxy、NHS)，偶联pH值（6·0,7·0,8·0,9·0，10·0)，偶联时间（0，l，2,3,4， 6h)对偶联效率的影响，得到最佳偶联方式及相关参数； 偶联条件优化见图3 c.最大吸附量考察：在最佳偶联条件下，制备6个不同批次的AAC和对照柱（未 偶联适体），确定最大吸附量，并与商业化的适体柱相比较。 最大吸附量考察见图4 (2) AAC适用性考察：以药用部位分类选择易被霉菌污染的中药材（种子果实类、 根及根茎类、花类、叶及全草类、动物类），综合考虑中药材中所含相关次生代谢产物（糖 类、淀粉、黄酮类、生物碱类、苯丙素类等），通过计算加样回收率方式考察这些中药材及所 含成分对AAC柱效的影响，并考察AAC净化后对降低基质效应的影响。 a.种子果实类：肉豆蘧，胡椒，小茴香，酸枣仁，胖大海，桃仁，陈皮，柏子仁，莲子， 使君子，槟榔，生麦芽，决明子，薏该仁，大麥，白扁豆，杏仁，积棋子，木瓜，淡豆豉； b.根及根茎类：甘草，姜黄，生姜，远志，半夏，郁金，人参，西洋参，当归，葛根，黄 芪，黄芩，白芍，天麻，麦冬，板蓝根，石斛，党参，延胡索，巴戟天； c.花类：红花，菊花，金银花，槐花，金莲花，辛夷； d.叶及全草类：淡竹叶，荷叶，桑叶，侧柏叶，银杏叶，薄荷，广藿香，芫荽，益母草， 青蒿； e.动物类：龟板，蜈蚣，水蛭，全蝎，僵蚕，地龙，乌梢蛇，土鳖虫，鸡内金。 (3) AAC实际应用性考察-基于AAC净化建立不同分析方法检测中药中OTA :考察 不同影响因素（稀释缓冲液类型，总离子强度，PH值，体积等）对柱效的影响，获得最佳净 化参数，以AAC为净化方法，建立不同检测方法（HPLC-FLD，UPLC-FLR，UFLC-MS / MS)，并 对比其他不同前处理方法（QuEChERS，MSro，各种SPE小柱）在代表性中药中OTA的净化效 果。 该制备方法的优点在于：适体能够与复杂基质（中药）中痕量的OTA特异性结合， 净化效果好，且精确性高、重复性好、无批次间差异、检测成本低；AAC制备过程简便易行， 生产成本低，质量稳定可控，易于实现机械化操作，能够满足工业化生产需求。【具体实施方式】 通过以下实施例对本专利技术进一步说明。以下所列举的实施例不以任何方式构成限 制。 溶液配制：PBS :8g NaCl，I. 2g Na2HPO4,0· 2g KH2PO4,0· 2g KCl 溶解于 1000 mL 水 中（ρΗ7·0) ;BBS1:10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl2(pH7.5) ;BBS2:12.5mMTris， 150mM NaCl，6· 25mM KCl，6· 25mM MgCl2 ;EBS:IOmM Tris，120mM NaCl，5mM KCl(ρΗ7· 5)。运 用2M HCl和2M NaOH调节pH值。 实施例1 :AAC的制备 (1)制备步骤： a.适体复性：取2. 7nmol的5'氨基修饰的适体溶解于400 μ L缓冲液中（200mM Na2HP045mM MgCl2, ρΗ8· 0)，75°C 下复性 5min，室温放置 30min ; b.洗漆：取约 200 μ L NHS-activated sephaorse4FF凝胶用 ImL HCl (ImM，ρΗ3· 0) 迅速反复洗涤5次； C.偶联：移去多余盐酸，迅速加入复性好的适体缓冲液，调节pH至8. 0,室温摇床 震摇反应3h ; d.封闭：反应完成后，用 3mLNa2HP04(200mM，pH8. 0)洗涤，加入 ImLTris-HCl 缓冲 液（0. 1M，pH8. 0)室温反应2h封闭剩余活性位点； e.洗涤：用 2mL Tris-HCl 缓冲液（0. 1M，pH8. 0,含 0. 5M NaCl)和 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种赭曲霉毒素A(OTA)适体亲和柱的制备方法及其检测技术，其特征在于：(1)以NHS活化的sepharose4FF为载体，OTA适体特异性DNA配基为吸附剂制备适体亲和柱；(2)以适体亲和柱为净化方法，UPLC‑FLR为检测技术建立姜粉中OTA检测方法；(3)以适体亲和柱为净化方法，UFLC‑MS／MS为检测技术建立中药中OTA检测方法。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨美华，杨锡辉，孔维军，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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