本发明专利技术涉及具有凝结剂活性的经修饰的凝血因子VII(因子VII)多肽，以及编码表达此类多肽的多核苷酸构建体、包含且表达此类多核苷酸的载体和宿主细胞、药物组合物、用途和治疗方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设及具有促凝活性的经修饰的凝血因子VII(因子VII)多肤。它还设及 编码此类多肤的多核巧酸构建体、包含且表达此类多核巧酸的载体和宿主细胞、包含此类 多肤的药物组合物、W及此类多肤的用途和治疗方法。 通过引用并入本文的序列表 SEQIDNO: 1 ;野生型人凝血因子VII。[000引专利技术背景 对血管的损伤活化止血系统，其设及细胞和分子组分之间的复杂相互作用。最终引起 出血停止的过程称为止血。止血的重要部分是在损伤部位处的血液凝固和凝块形成。凝血 过程高度依赖几种蛋白质分子的功能。该些称为凝血因子。凝血因子中的一些是可失 活酶原或酶促活性形式存在的蛋白酶。通过由另一种蛋白酶解活性凝血因子催化的多肤链 的特异性切割，酶原形式可W转换为其酶促活性形式。因子VII是在肝中合成且作为单链 糖蛋白分泌到血液内的维生素K依赖性血浆蛋白质。通过在单个位点处即在SEQIDNO: 1 的R152和1153之间的特异性蛋白酶解切割，因子VII酶原转换为活性形式（因子Vila)， 产生由单个二硫键连接的双链分子。因子Vila中的两条多肤链被称为轻和重链，分别对应 于SEQIDNO: 1(野生型人凝血因子VII)的残基1-152和153-406。因子VII占优势地作 为酶原循环，但较少部分采取活化形式（因子Vila)。 血液凝固过程可W分成=个时期：初始、扩大和传播。初始和传播期促使凝血酶形 成，所述凝血酶是在止血中具有许多重要功能的凝血因子。如果排列在血管内表面的内皮 细胞的单层屏障发生受损，则凝血级联起始。该暴露出血液中的血小板将与之粘附的内皮 下细胞和血管外基质蛋白质。如果该发生，则存在于内皮下细胞表面上的组织因子（T巧变 得暴露于在血液中循环的因子Vila。TF是膜结合蛋白质，并且充当因子Vila的受体。因 子Vila是具有固有的低活性的酶，即丝氨酸蛋白酶。然而，当因子Vila与TF结合时，它的 活性极大增加。因子Vila与TF相互作用也将因子Vila定位于具有TF的细胞的磯脂表面 上，并且将其最佳放置用于将因子X活化为Xa。当该发生时，因子Xa可W与因子Va组合， W在具有TF的细胞的表面上形成所谓的"凝血酶原酶"复合物。凝血酶原酶复合物随后通 过切割凝血酶原而生成凝血酶。通过使TF暴露于循环因子Vila而活化且导致凝血酶的初 始生成的途径称为TF途径。TF:因子Vila复合物也催化因子IX至因子IXa的活化。随后 活化因子IXa可W扩散至血小板表面，所述血小板粘附至损伤部位且已活化。该允许因子 IXa与FVIIIa组合，W在活化血小板的表面上形成"tenase"复合物。由于其在将因子X活 化为Xa中的显著效率，该复合物在传播期中起关键作用。有效的tenase催化的因子Xa活 性的产生，进而又导致由凝血酶原酶复合物催化的凝血酶原至凝血酶的有效切割。 如果在因子IX或因子VIII中存在任何缺陷，则它损害重要的tenase活性，并且 降低凝血所需的凝血酶产生。最初由TF途径形成的凝血酶充当促凝信号，其鼓励血小板在 损伤部位处的召募、活化和聚集。该导致松散的原始血小板塞的形成。然而，该原始血小板 塞是不稳定的且需要强化W支持止血。塞的稳定设及将血小板错定且纠缠在纤维蛋白纤维 网中。 坚固且稳定的凝块的形成依赖于产生局部凝血酶活性的强爆发。因此，在血管损 伤后导致凝血酶生成的过程中的缺陷可W导致出血障碍，例如A和B型血友病。具有A和 B型血友病的人分别缺乏功能因子Villa或因子IXa。在传播期中的凝血酶生成严重依赖 tenase活性，即需要因子Villa和FIXa两者。因此，在具有A或B型血友病的人中，无法进 行原始血小板塞的适当固结，且持续出血。 替补疗法是用于A和B型血友病的传统治疗，并且设及因子VIII或因子IX的静 脉内施用。然而，在许多情况下，患者产生针对输注蛋白质的抗体（也称为抑制剂），该降低 或取消治疗的功效。重组因子Vila(Novoseven?)已被批准用于治疗具有抑制剂的A或B 型血友病患者，并且还用于终止出血发作或预防与创伤和/或手术相关的出血。重组因子 Vila也已被批准用于治疗具有先天性因子Vn缺陷的患者。已提出重组FVIIa通过不依赖 TF的机制运转。根据该模型，重组FVIIa由于其Gla结构域导向活化血液血小板的表面，在 此处，它随后将因子X蛋白酶解活化为Xa，因此绕过功能性tenase复合物的需要。在不存 在TF的情况下，FVIIa的低酶促活性W及Gla结构域对于膜的低亲和力可W解释实现具有 血友病的人中的止血所需的超生理学水平的循环FVIIa的需要。[000引重组因子Vila具有2-3小时的体内功能半衰期，其可能需要频繁施用W解决患者 中的出血。进一步地，患者通常仅在出血已开始后接受因子Vila疗法，而不是作为预防措 施，该通常影响其一般生活质量。具有更长的体内功能半衰期的重组因子Vila变体将降低 所需施用数目，支持更不频繁的给药且因此保留出于患者和护理持有者（care-holder)的 利益显著改善因子Vila疗法的希望。 W02007031559 (7012)公开了对通过抗凝血酶的抑制敏感性降低的因子VII变 体。 W02009126307 (催化剂）公开了促凝活性改变的经修饰的因子VII多肤。 一般而言，在具有凝血病的人中存在许多未满足的医疗需要。重组因子Vila促进 凝块形成的用途突出了其作为治疗剂的增长的重要性。然而，重组因子Vila疗法仍留下显 著未满足的医疗需要，并且存在具有改善的药学特性，例如增加的体内功能半衰期和改善 的活性的重组因子Vila多肤的需要。 专利技术概述 本专利技术提供了经修饰的因子vn多肤，其经设及而具有改善的药学特性。在广泛方面， 本专利技术设及与人野生型因子Vila相比较，显示出增加的体内功能半衰期的因子VII多肤。 在另一个广泛方面，本专利技术设及因子VII多肤，其显示出对通过内源血浆抑制剂特别是抗 凝血酶的失活的抗性增加。在进一步广泛方面，本专利技术设及具有增强或基本上保持的活性 的因子VII多肤。 本文提供的是具有增加的体内功能半衰期的因子VII多肤，其包含赋予增强的对 抗凝血酶失活的抗性和很少或无蛋白酶解活性丧失的突变组合。在本专利技术的特别有利的方 面，因子VII多肤与一种或多种"延长半衰期的基团"偶联，W增加体内功能半衰期。 在一个方面，本专利技术设及相对于人因子VII的氨基酸序列（SEQIDNO: 1)，包含两 个或更多个取代的因子VII(a)多肤， 其中所述取代中的至少一个是其中1293已替换为1^73化)、17^巧、4'肖(时或化6(巧； 其中9176已替换为1^73化)、4'3佩、4311觀；和/或9286已替换为4311(脚，并且其中所述 取代中的至少一个是其中M298已替换为Gin(曲、Lys化)、Arg(R)、Asn(脚、Gly佑)、Pro任）、 Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、lie(I)、Phe巧）、lYp(W)、Tyr(Y)、Asp值）、Glu巧）、His(H)、 切s似、Ser做或！'虹(T)。 在有利实施方案中，本专利技术设及与至少一种延长半衰期的部分偶联的因子VII (a)多肤。 在另一个方面，本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，包含两个或更多个取代的因子VII (a)多肽，其中所述取代中的至少一个是其中T293已替换为Lys(K)、Tyr(Y)、Arg(R)或Phe(F)；其中Q176已替换为Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)；和/或Q286已替换为Asn(N)，和其中所述取代中的至少一个是其中M298已替换为Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R)、Asn(N)、Gly(G)、Pro(P)、Ala (A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)、Asp(D)、Glu(E)、His(H)、Cys(C)、Ser(S)或Thr(T)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：HR斯坦尼克，OH奧森，H奧斯特加亚尔德，
申请(专利权)人：诺和诺德保健AG股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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