一种中缅树鼩组织DNA的提取方法技术

本发明专利技术提供了一种中缅树鼩组织DNA的提取方法，包括以下步骤：a)将中缅树鼩组织在匀浆液中离；b)将步骤a)获得的上清液离心；c)将步骤c)获得的沉淀在匀浆液中离心；d)将步骤c)获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶；e)将步骤d)获得的溶液以第三溶液混合，冰溶；f)将步骤e)获得的溶液离心；g)将步骤f)获得的上清液在混合溶液中抽提，重复一次；h)将步骤g)获得的上清液与无水乙醇混合，放置过夜；i)将步骤h)获得的溶液离心，用乙醇洗涤干燥。本发明专利技术通过限定提取过程中试剂种类、试剂用量以及提取条件，提取得到的DNA纯度较高，电泳条带无拖尾现象，且成本较低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于DNA提取
，尤其涉及一种中緬树駒组织DNA的提取方法。
技术介绍
中緬树駒是一类小型的攀援型哺乳动物，形似松鼠，在种系上较小鼠、大鼠等常用啮齿类实验动物更接近人类，并且能够罹患许多与人相似的疾病，是目前除黑猩猩、长臂猿夕卜，唯一能够感染人类乙肝病毒的动物，受到了生物学与医学工作者的高度关注。对中緬树駒进行研宄时，提取其组织DNA是必不可少的步骤之一。现有技术公开了诸多其他动物DNA的提取方法，但这些方法均不适用于中緬树駒组织NDA的提取，提取得到的DNA纯度较低，DNA的电泳条带拖尾现象严重。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种中緬树駒组织DNA的提取方法，本专利技术提供的提取方法提取得到中緬树駒的DNA纯度较高，电泳条带无拖尾现象。本专利技术提供了一种中緬树駒组织DNA的提取方法，包括以下步骤:a)将中緬树_组织在勾楽液中在3?5°C、1200r/min?1800r/min条件下离心8min?12min，所述中緬树_组织与勾楽液的质量体积比为0.15?0.25g:0.5?1.5mL ；b)将步骤a)获得的上清液在3?5 °C、1200r/min?1800r/min条件下离心18min ?22min ；c)将步骤c)获得的沉淀在匀浆液中在3?5°C、1200r/min?1800r/min条件下离心8min?12min，所述勾楽液与中緬树_组织的体积质量比为1.5?2.5mL:0.15?0.25g ；d)将步骤c)获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶Smin?12min ;所述第一溶液包括Tris-HCl、Na2EDTA和NaCl ;所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠；所述第一溶液、第二溶液和中緬树駒组织的体积质量比为40?60 yL:90?110 μ L:0.15 ?0.25g ；e)将步骤d)获得的溶液以第三溶液混合，冰溶50min?70min ;所述第三溶液包括钾离子和醋酸离子；所述第三溶液与第二溶液的体积比为70?80:90?110 ;f)将步骤e)获得的溶液在11000r/min?13000r/min条件下离心8min?12min ；g)将步骤f)获得的上清液在混合溶液中在11000r/min?13000r/min条件下抽提2?3min，重复一次；所述混合溶液包括酚、氯仿和异戊醇；所述上清液与所述混合溶液的体积比为0.8?1.2:0.8?1.2 ;h)将步骤g)获得的上清液与3°C?5°C的无水乙醇混合，在_35°C?_45°C放置过夜；i)将步骤h)获得的溶液在3°C?5°C、11000r/min?13000r/min下离心15min?30min，用3°C?5°C乙醇洗涤干燥。本专利技术首先将中緬树駒的组织在匀浆液中进行离心提取线粒体DNA，中緬树駒组织与勾楽液的质量体积比优选为0.2g:lmL，所述离心的条件优选为4°C、1500r/min，离心时间优选为lOmin。所述匀浆液中包括蔗糖、Na2EDTA、Tris-HCl、CaCl2，优选包括0.25mol/L 鹿糖、10mmol/L Na2EDTA、30mmol/L Tris-HCl 和 2.5mmol/L CaCl20 所述勾楽液的 pH 值优选为8.2。经过第一次离心获得上清液后，继续在3?5°C、1200r/min?1800r/min条件下离心18min?22min。第二次离心的条件优选为4°C、1500r/min离心20min。第二次离心完毕后，弃上清液后得到的沉淀在匀浆液中在3?5°C、1200r/min?1800r/min条件下离心8min?12min。第三次离心的条件优选为4°C、1500r/min离心10min?第三次离心使用的匀浆液与第一次离心上使用的匀浆液相同，包括蔗糖、Na2EDTA,Tris-HCl, CaCl2,优选包括 0.25mol/L 蔗糖、10mmol/L Na2EDTA、3OmmoI/L Tris-HCl 和2.5mmol/L CaCl20所述匀浆液的pH值优选为8.2。第三次离心使用的匀浆液与中緬树駒组织的体积质量比为1.5?2.5mL:0.15?0.25g，优选为2mL:0.2g。第三次离心完毕后，将得到的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶8min?12min。其中，所述第一溶液包括Tris-HCl、Na2EDTA和NaCl，优选包括1mmol/L Tris-HClU0mmol/L Na2EDTA 和 0.15mmol/L NaCl ;所述第一溶液的 pH 值为 8.0。将第三次离心完毕后得到的沉淀与第一溶液混合后轻轻吹打混合均匀，然后与第二溶液混合后冰溶8min?12min，优选冰溶lOmin。所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠，优选包括Iwt %的十二烷基硫酸钠和0.2mmol/L NaOHo所述第一溶液、第二溶液和中緬树駒组织的体积质量比为 40 ?60 μ L:90 ?110 μ L:0.15 ?0.25g，更优选为 50 μ L:100 μ L:0.2g。然后再将得到的溶液与第三溶液混合，冰溶50min?70min，优选60min。所述第三溶液包括钾离子和醋酸离子，其中，钾离子浓度优选为3mol/L，所述醋酸根离子浓度优选为5mol/L。第三溶液和第二溶液的体积比为70?80:90?110，优选为75:100。将获得的溶液在11000r/min?13000r/min条件下离心8min?12min，第四次离心的条件优选为12000r/min，离心lOmin。将第四次离心获得的上清液在混合溶液中在11000r/min?13000r/min条件下抽提2?3min，重复一次，抽提条件优选为12000r/min。其中，所述混合溶液为酸氯仿，包括酚、氯仿和异戊醇，酚、氯仿和异戊醇的体积比为24:24:1。所述上清液和混合溶液的体积比为0.8?1.2:0.8?1.2，优选为1:1。将抽提后获得的上清液与3°C?5°C的无水乙醇混合，在_35°C?_45°C下放置过夜。其中，无水乙醇优选为4°C，放置过夜的温度优选为-40°C。在冷冻过夜的溶液在3 °C?5 °C、11000r/min?13000r/min下离心15min?30min，用4°C乙醇洗涤干燥，即可提取得到DNA。其中，第五次离心的条件优选为4°C、12000r/min。所述乙醇优选为75%的乙醇。本专利技术提供的提取方法的一个典型实施例如下:a)将中緬树_组织在勾楽液中4°C、1500r/min条件下离心lOmin，所述中緬树_组织与匀浆液的质量体积比为0.2g:lmL ；b)将步骤a)获得的上清液在4°C、1500r/min条件下离心20min ；c)将步骤c)获得的沉淀在勾楽液中在4°C、1500r/min条件下离心lOmin，所述勾浆液与中緬树駒组织的体积质量比为2mL:0.2g ；d)将步骤c)获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶1min ;所述第一溶液包括Tris-HCl、Na2EDTA和NaCl ;所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠；所述第一溶液、第二溶液和中緬树駒组织的体积质量比为50 μ L:100 μ L:0.2g ；e)将步骤d)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中缅树鼩组织DNA的提取方法，包括以下步骤：a)将中缅树鼩组织在匀浆液中在3～5℃、1200r/min～1800r/min条件下离心8min～12min，所述中缅树鼩组织与匀浆液的质量体积比为0.15～0.25g：0.5～1.5mL；b)将步骤a)获得的上清液在3～5℃、1200r/min～1800r/min条件下离心18min～22min；c)将步骤c)获得的沉淀在匀浆液中在3～5℃、1200r/min～1800r/min条件下离心8min～12min，所述匀浆液与中缅树鼩组织的体积质量比为1.5～2.5mL：0.15～0.25g；d)将步骤c)获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶8min～12min；所述第一溶液包括Tris‑HCl、Na2EDTA和NaCl；所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠；所述第一溶液、第二溶液和中缅树鼩组织的体积质量比为40～60μL：90～110μL：0.15～0.25g；e)将步骤d)获得的溶液与第三溶液混合，冰溶50min～70min；所述第三溶液包括钾离子和醋酸离子；所述第三溶液与第二溶液的体积比为70～80:90～110；f)将步骤e)获得的溶液在11000r/min～13000r/min条件下离心8min～12min；g)将步骤f)获得的上清液在混合溶液中在11000r/min～13000r/min条件下抽提2～3min，重复一次；所述混合溶液包括酚、氯仿和异戊醇；所述上清液与所述混合溶液的体积比为0.8～1.2:0.8～1.2；h)将步骤g)获得的上清液与3℃～5℃的无水乙醇混合，在‑35℃～‑45℃放置过夜；i)将步骤h)获得的溶液在3℃～5℃、11000r/min～13000r/min下离心15min～30min，用3℃～5℃乙醇洗涤干燥。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王政昆，朱万龙，高文荣，张浩，章迪，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53