兼性减毒细菌种类及其制备和使用方法技术

本发明专利技术提供了兼性减毒细菌种类及其制备和使用方法。如本文所使用的术语“兼性减毒”指包含一组限定重组修饰的细菌，所述重组修饰当所述细菌在其宿主生物外部时，大体上对所述细菌通过增殖而生长的能力无影响，但是当将所述细菌引入其宿主生物，例如接种受者的宿主细胞内时，导致所述细菌增殖所必需的一个或多个基因缺失。这些重组修饰利用优先诱导基因在所述哺乳动物宿主内表达的调控序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请案的交叉引用 本申请要求2012年11月6日提交的美国临时申请第61/723, 234号的权益，其特 此以其整体包括所有表格、附图和权利要求在内并入。 专利技术背景 下面对专利技术背景的讨论仅仅是为了帮助读者理解本专利技术而提供而未被承认用于 描述或构成本专利技术的现有技术。 根据定义，病原生物能够在受感染的宿主中引起疾病。为了临床使用这类生物，常 常产生表现出毒力降低或消除，但是仍然保持刺激针对目标病原体或异种抗原的所需免疫 反应的足够活力的减毒疫苗菌株。已经证明减毒载体平台在许多实验模型，包括传染病和 恶性疾病中，引起对编码的异种抗原有特异性的保护性反应。 虽然大多数减毒疫苗载体为病毒性的，但是已经开发出细菌疫苗载体平台供预防 和治疗应用。许多其它病原菌的减毒菌株目前可用并且生成重组菌株易于操纵提供了将细 菌用作许多外源蛋白，例如与传染病和癌症相关的抗原的有效递送媒介物的方式。尤其， 已经由李斯特菌（Listeria)、埃希氏菌（Escherichia)、沙门氏菌（Salmonella)、志贺菌 (Shigella)、乳酸杆菌（Lactobacillus)和耶尔森氏菌（Yersinia)种类开发出了活减毒细 菌疫苗菌株。 虽然这种疫苗菌株可能表现出毒力降低，但是其安全性，特别是在免疫力低下的 个体中，仍令人担忧。进一步降低细菌疫苗风险的策略的一个实例为所说的杀死但具有代 谢活性（"KBMA"）的方法。通过DNA修复基因例如UVrA和UVrB的缺失，消除核苷酸切除 修复的能力，构建KBM疫苗菌株。基因缺失致使细菌对通过补骨脂素和UVA联合治疗的光 化学灭活极其敏感。由于其不能修复所形成的补骨脂素诱导的DNA交联，所以KBM细菌菌 株无法复制并且因此在功能上无感染性。与活减毒菌株相比，这种特征提供了改善的安全 性。然而交联数量非常有限保存了其代谢活性，包括抗原表达，并因此保存其免疫潜力。然 而，生产表现出一致性质的KBM菌株可能很难，因为对交联数量的滴定取决于许多难以控 制的变量。 在本领域中仍然需要提供具有有利安全性，用于治疗或预防具有风险-效益，不 适于活减毒疫苗的疾病的减毒细菌疫苗菌株。 专利技术概述 本专利技术提供了。如本文所使用的术语"兼 性减毒"指包含一组限定重组修饰的细菌，所述重组修饰当所述细菌在其宿主生物外部时， 大体上对所述细菌通过增殖而生长的能力无影响，但是当将所述细菌引入其宿主生物，例 如接种受者的宿主细胞内时，导致所述细菌增殖所必需的一个或多个基因缺失。这些重组 修饰利用优先诱导基因在哺乳动物宿主内表达的调控序列。 如下文所述，所述细菌最优选为细胞内病原体，例如单核细胞增多性李斯特菌 (Listeriamonocytogene)〇 在本专利技术的第一个方面，本专利技术涉及一种构造细菌以使所述细菌基因组内对所述 细菌的增殖必需的一个或多个基因缺失的方法，所述缺失优先在将所述细菌引入宿主时发 生。所述方法包括： (i)向所述细菌内重组引入编码与所述细菌异源的重组酶的核酸，其中编码所述 重组酶的所述核酸与优先诱导所述重组酶在哺乳动物宿主内表达的调控序列可操作地连 接，和 (ii)在所述细菌基因组内，在对所述细菌增殖必需的基因上游重组引入所述重组 酶的第一附着位点，并且在对所述细菌增殖必需的基因下游重组引入所述重组酶的第二附 着位点。 所述重组酶当在所述哺乳动物宿主内特异性诱导和表达时，催化使两侧为所述第 一和第二附着位点，对所述细菌增殖必需的基因缺失的位点特异性重组事件。在该位点特 异性重组事件之后，所述细菌具有增殖缺陷。 如本文所使用的短语"大体上对所述细菌通过增殖而生长的能力无影响"指其中 菌落形成为其它方面相同，但是缺乏上述的限定重组修饰的细菌的至少75%的细菌。为方 便起见，本文将缺乏经重组引入的重组酶序列和经重组引入的第一和第二附着位点的这种 细菌称为"野生型"细菌。在优选的实施方案中，菌落形成为野生型细菌的菌落形成的至少 80%，更优选为野生型细菌的至少90%，并且最优选为野生型细菌的至少95 %。在体外菌 落形成试验中测定菌落形成，并且表示为菌落形成单位（CFU)。 如本文关于一个基因（或多个基因）所使用，术语"对增殖必需"指基因缺失时，产 生其中菌落形成减少至野生型的1%或更低，和/或其中细菌在生物所含宿主细胞中的生 长（按CFU测量）相对于野生型降低至少1000倍的细菌。优选地，菌落形成减少至野生型 的0.01%或更低。本文称已经缺失这样一个基因（或多个基因）的细菌"具有增殖缺陷"。 在本专利技术的上下文中，对增殖必需的一个基因（或多个基因）的缺失优先在将细 菌引入宿主生物时发生。如本文所使用，如果细菌引入宿主生物使菌落形成为野生型细菌 的菌落形成的至少75%的细菌转化为菌落形成减少至野生型的1%或更少的细菌，则缺失 事件"优先在宿主中"发生。优选地，菌落形成减少至野生型的0.01%或更低。 术语"优先诱导所述重组酶在宿主细胞内表达的调控序列"指细菌引入宿主生物 后，诱导基因在其控制下表达至少10倍的调控序列。仅举例而言，基因在李斯特菌的actA 启动子下的表达取决于称为PrfA、用于转录激活的调节因子。相对于肉汤培养的李斯特菌， 当李斯特菌存在于宿主细胞内时，大致诱导actA/PrfA调控下的基因表达200倍。因此，在 某些实施方案中，调控序列包括为PrfA依赖型的单核细胞增多性李斯特菌启动子。PrfA依 赖型启动子可选自inlA启动子、inlB启动子、inlC启动子、hpt启动子、hly启动子、plcA 启动子、mpl启动子和actA启动子。下文描述了对于其它细菌种类，诱导宿主生物中基因 表达的类似系统。在优选的实施方案中，这种优先诱导的表达在将细菌引入宿主生物后增 加至少50倍，更优选至少100倍，更加优选至少1000倍。 如本文所使用的术语"宿主生物"指目标细菌在如本文所述对增殖必需的一个基 因（或多个基因）没有缺失时能够在其中增殖的生物。在某些实施方案中，宿主生物为哺乳 动物种类，最优选为人。同样，在某些实施方案中，细菌为细胞内病原体，并且当细菌在哺乳 动物宿主细胞内时，调控序列优先诱导重组酶的表达。优选的细菌属选自李斯特菌属、奈瑟 球菌属（Neisseria)、分支杆菌属（Mycobacterium)、弗朗西斯菌属（Francisella)、杆菌属 (Bacillus)、沙门氏菌属（Salmonella)、志贺菌属（Shigella)、耶尔森氏菌属（Yersinia)、 布鲁氏菌属（Brucella)、军团菌属（Legionella)、立克次氏体属（Rickettsia,)和衣原体 属（Chlamydia)。该列表并非意在限制。更优选地，细菌为兼性胞内细菌，例如李斯特菌、沙 门氏菌、志贺菌、弗朗西斯菌、分支杆菌、军团菌、伯克霍尔德菌（Burkholderia)和布鲁氏 菌（Brucella)。在下文所述的某些示例性实施方案中，所述细菌为单核细胞增多性李斯特 菌，包括经修饰的诸如单核细胞增多性李斯特菌AActA/AInlB(其中天然ActA和InlB基 因已经缺失或因突变致使功能上缺失的单核球增多性李斯特菌）。 正如上面所提到的，经重组引入细菌内的重组酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构造细菌以使所述细菌基因组内对所述细菌的增殖必需的一个或多个基因缺失的方法，所述缺失优先在将所述细菌引入哺乳动物宿主时发生，所述方法包括：(i)向所述细菌内引入编码与所述细菌异源的重组酶，与优先诱导所述重组酶在所述哺乳动物宿主内表达的调控序列可操作地连接的核酸，和(ii)在所述细菌基因组内，在对所述细菌增殖必需的基因上游引入所述重组酶的第一附着位点，并且在对所述细菌增殖必需的基因下游引入所述重组酶的第二附着位点，以致所述重组酶在所述哺乳动物宿主内表达时，催化使两侧为所述第一和第二附着位点，对所述细菌增殖必需的基因缺失的位点特异性重组事件，其中在所述位点特异性重组事件之后，所述细菌具有增殖缺陷。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·G·汉森，J·斯库伯，P·M·劳尔，
申请(专利权)人：艾杜罗生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US