本发明专利技术属于生物制药领域，提供一种表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点(SA蛋白)的重组猪痘病毒载体疫苗，该疫苗包括重组猪痘病毒rSPV-SA，其包括猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点编码基因，该编码基因序列如SEQID NO.1所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点即SA蛋白。本发明专利技术首次成功研制了表达猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点的重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-SA，该重组猪痘病毒载体疫苗突破了猪传染性胃肠炎病毒常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性，兼具有弱毒疫苗的免疫效果好和灭活疫苗的安全性高等特点，而且对人、猪等动物没有致病性，安全性较高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域，涉及一种表达猪传染性胃肠炎病毒s蛋白A位点（SA 蛋白）的重组猪痘病毒载体疫苗，具体涉及表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码 基因、重组猪痘病毒载体疫苗和重组猪痘病毒的制备方法。
技术介绍
猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由猪传染 性胃肠炎病毒（(Transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)引起的高度接触性传染病， 可引起猪呕吐、水样腹泻。TGEV主要存在于猪的空肠和十二指肠，其次为回肠，各日龄猪均 易感染。由于仔猪肠道内尚未建立稳定的微生态系统，自身抵抗力较低，对外界刺激敏感， 因此，感染TGEV后常因脱水而死亡，尤以10日龄以内的仔猪发病率、死亡率最高，死亡率可 尚达100 %。 S蛋白（Spike protein)突出于TGEV病毒粒子表面，形成典型的花瓣状突起，长约 20nm。S蛋白的膜外区上分布有该蛋白的主要抗原位点、宿主细胞氨肤酶受体（pAPN)的识 别位点以及一段DRTRG序列。早在1979年研宄发现，S蛋白具有对TGEV的免疫保护作用。 通过放射免疫分析进一步证实，S蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导产 生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白。S蛋白抗原位点分为A、B、C、D共4个位点， 研宄表明4个抗原位点都位于S蛋白N端543个氨基酸残基之内，由仅占2. 2kb的S基因 5'端基因片段编码。A位点位于S蛋白氨基酸序列的538-591位范围，暴露在病毒粒子表 面，依赖于细胞内糖基化。A位点为不连续抗原位点，可分为Aa、Ab和Ac等3个亚位点，应 用抗原决定簇扫描定位亚位点对应的氨基酸残基证实，氨基酸残基538、591和543位对A 位点的Aa、Ab和Ac等3个亚位点的形成分别起着关键作用，而残基586位同时影响Aa、Ab 亚位点的形成，这表明A位点具有复杂的空间结构。 作为疫苗表达载体，猪痘病毒（Swinepox virus，SPV)有许多特有的优点：（l)SPV 作为基因重组疫苗的载体，不仅可以诱导机体产生良好的体液免疫反应，而且可以诱导很 强的细胞免疫反应。（2)SPV基因组允许大片段的删除以及外源基因的插入。（3)重组SPV 载体疫苗有多种接种途径，可通过口服进行免疫接种。利用SPV载体表达TGEV的S蛋白基 因的重组疫苗国内外迄今尚无成功报道，更没有利用SPV载体表达TGEV的S蛋白A位点预 防TGE的疫苗或药物的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是研制一种能够有效防制猪传染性胃肠炎的重组猪痘病毒载体疫 苗，对猪传染性胃肠炎的预防工作提供有力的支持。 本专利技术的目的通过以下技术方案实现 1.本专利技术提供一种猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码基因，该基因序列如 SEQID NO. 1所示，用于制备重组猪痘病毒rSPV-SA。 2.本专利技术还提供一种重组猪痘病毒rSPV-SA，该重组猪痘病毒通过在猪痘病毒载 体中插入猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点编码基因重组制备得到，A位点编码基因序列 如SEQID NO. 1所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点即目的蛋白SA。 通过试验，目的蛋白SA能够在重组猪痘病毒中有良好的表达，重组猪痘病毒能在 猪体内表达目的蛋白SA。 3.上述2提供的重组猪痘病毒，其中，猪痘病毒载体为Kasza株（ATCC :VR363?)。 4.本专利技术还提供一种预防猪传染性胃肠炎的疫苗，该疫苗包括重组猪痘病毒 rSPV-SA，其包括猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点编码基因，该编码基因序列如SEQID NO. 1所示，能够表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点。 通过动物免疫试验，该疫苗能够刺激免疫动物产生高效价的猪传染性胃肠炎病毒 血清中和抗体。 5.本专利技术还提供上述1提供的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码基因在制 备预防猪传染性肠胃炎的药物上的应用。 6.上述2或3提供的重组猪痘病毒rSPV-SA在制备预防猪传染性肠胃炎的药物上 的应用。 7.上述2或3提供重组猪痘病毒的制备方法，该方法包括如下步骤： (1)引物设计：以S蛋白A位点编码基因为基础，设计引物序列，在引物5'端分别 引入限制性内切酶BamH I和Sal I的酶切位点； (2)目的基因片段与载体连接：以猪传染性胃肠炎病毒JS2012株的RNA为模板， 通过RT-PCR反应，获得目的基因片段SA;以BamH I和Sal I酶切目的基因片段和穿梭载体 PUSZ11/P28M，凝胶电泳回收；在连接酶缓冲液中，连接酶切后目的基因片段和穿梭载体，获 得含有目的基因片段SA的穿梭载体pUSZll/P28SA ; (3)重组猪痘病毒的获取：用脂质体转染法使穿梭载体PUSZ11/P28SA与猪痘病毒 Kasza株发生同源重组，获得重组猪痘病毒rSPV-SA原液； (4)通过细胞痘斑纯化重组猪痘病毒rSPV-SA。 8.上述8提供的重组猪痘病毒的制备方法，其中，所述引物序列如下， SA1 :5' -GCGTCGACATGGGTCTTGGTATGAAGCGTAG-3' ； SA2 :5' -CGGGATCCTTATAGCGTCCTGTTAGTTTGTC-3'。 9.上述8提供的重组猪痘病毒的制备方法，其中，所述重组猪痘病毒的获取方法 为：以猪痘病毒感染PK15单层细胞，lh后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到PK15单层 细胞，5_6h后换成细胞维持液，继续培养2-3天；待细胞出现50%以上细胞病变后，将其反 复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-SA原液。本专利技术所述疫苗的接种途经包括但不限于 肌肉注射等。 本专利技术的有益效果： 1.本专利技术首次成功研制了表达猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点的重组猪痘病毒 载体疫苗rSPV-SA，该重组猪痘病毒载体疫苗突破了猪传染性胃肠炎病毒常规灭活疫苗和 弱毒疫苗的局限性，兼具有弱毒疫苗的免疫效果好和灭活疫苗的安全性高等特点，而且对 人、猪等动物没有致病性，安全性较高。 2.试验证明，本专利技术构建的表达猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点的重组猪痘病 毒载体疫苗目的蛋白SA表达稳定，病毒的滴度稳定在1. OX 107TCID5(l/mL。通过病毒中和试 验证明了该重组猪痘病毒免疫实验动物后产生了针对TGEV的高效价的中和抗体，三免后 中和抗体效价最高可达1 : 1024,具有很好的免疫保护作用。 3.重组猪痘病毒对免疫动物不致病，与现在应用的猪传染性胃肠炎病毒商品化灭 活疫苗相比，该重组猪痘病毒能同时诱导免疫动物产生强烈的细胞免疫反应以及体液免疫 反应，且病毒中和抗体维持的时间更持久，因此该重组猪痘病毒活载体疫苗在猪传染性胃 肠炎病毒预防方面具有广阔的应用前景。【附图说明】 图1穿梭载体pUSZll/P28M。其中，BamH I和Sal I为酶切位点；LF和RF分别为 猪痘病毒的左、右同源交换序列；P11和P28为痘病毒启动子；LacZ为筛选标记基因；SA为 目的蛋白基因。 图2穿梭载体pUSZll/P28SA。其中，LF和RF分别为猪痘病毒的左、右同源交换序 列；P11和P28为痕病毒启动子；LacZ为筛选标记基因；SA为目本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的编码基因，其特征在于：该基因序列如SEQ ID NO.1所示，用于制备重组猪痘病毒rSPV‑SA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：范红结，蔺辉星，袁晓民，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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