一种猪伪狂犬病病毒疫苗制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种猪伪狂犬病病毒疫苗，由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有由保藏编号为CGMCC No.10266的猪伪狂犬病病毒株进行毒力基因缺失后制成的减毒病毒株。本发明专利技术制备的疫苗可有效预防猪伪狂犬病，而且作为抗原的猪伪狂犬病病毒为基因缺失株，通过水平传播感染在小鼠体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合猪伪狂犬病病毒缺失疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

【技术实现步骤摘要】
一种猪伪狂犬病病毒疫苗
本专利技术属于家畜疫苗制备
，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒疫苗。
技术介绍
猪伪狂犬病病毒PRV(Pseudorabiesvirus)属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科水泡病毒属猪疱疹病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病(Pseudorabies,PR)。该病在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。目前尚无治疗PR的有效药物，因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。世界上使用最广泛的疫苗主要是PRVBartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状为现有该疫苗不能完全保护新流行PRV的攻击，给免疫猪场造成了一定的经济损失。因此，需要提供最新流行毒株制备的疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪伪狂犬病病毒疫苗，即由筛选出的猪伪狂犬病病毒基因缺失株作为抗原制备的疫苗，本专利技术的疫苗对目前流行的猪伪狂犬病病毒的攻击能够提供良好的免疫保护效力。本专利技术的猪伪狂犬病病毒疫苗，由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有由保藏编号为CGMCCNo.10266的猪伪狂犬病病毒株进行毒力基因缺失后制成的减毒病毒株。所述的毒力基因优选为TK基因。其中的保护剂为目前使用的病毒疫苗用保护剂，其一种实施例具体成分为蔗糖和明胶的水溶液，其在疫苗中的质量百分比终浓度分别为20％和4.8％。上述的疫苗中加入了抗生素，青霉素、链霉素终浓度为200单位/ml；上述的疫苗的制备方法，是采用基因工程的方法将猪伪狂犬病病毒基因组的毒力基因进行缺失，在细胞上进行拯救，扩毒获得的病毒液，加入保护剂制成的。本专利技术制备的疫苗可有效预防猪伪狂犬病，而且作为抗原的猪伪狂犬病病毒为基因缺失株，通过水平传播感染在小鼠体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合猪伪狂犬病病毒缺失疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本领域的普通技术人员在本专利技术技术方案的基础上，可以选用本领域常用的方法步骤，而不仅限于本专利技术说明书实施例的具体记载。实施例1：猪伪狂犬病病毒株的选育近年来，我国多个猪场都发生了伪狂犬病，其中大部分是种猪场，而发病猪群之前已经注射了伪狂犬疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病猪群中进行了猪伪狂犬病毒的筛选。取发病猪内脏样本，包括：心脏、肝脏、肺脏、脾脏、扁桃体和淋巴结等。将内脏样本与PBS(0.1M,pH7.2)以V/V1:5制成匀浆，反复冻融3次，3000r/min离心15min，取上清中加双抗，37℃感作1h，经0.22μm滤膜过滤除菌。取1ml病毒滤液接种于长成单层的Vero细胞，盲传三代，观察细胞病变(CPE)。将出现CPE的细胞培养液进行空斑纯化，纯化后的病毒分装保存至-70℃备用，并测定病毒含量。选取作为疫苗研制的候选毒株，猪伪狂犬病病毒QD株(疱疹病毒Ⅰ型PorcineherpesvirusTypeⅠ)已于2015年3月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10266。对于本专利技术筛选的毒株进行PCR检测，测序后进行blast分析，发现保藏编号为CGMCCNo.10266的猪伪狂犬病病毒的gE基因与2012年之后报道的猪伪狂犬病病毒的相对应的序列虽然存在至少2个氨基酸的差异，但是亲缘关系较近，均处于一个相对独立的分支中，与之前分离的毒株亲缘关系较远。且与最近分离的毒株具有相同的分子特征，即在gE基因第48位和第492-496位各有1个天冬氨酸的插入，其他报道也证实也这一点。而以前分离到的毒株只个别有一个位置插入氨基酸，绝大部分没有插入。因此可以推测上述的差异正是导致已有的猪伪狂犬病病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。该毒株作100倍稀释后，与等量猪伪狂犬病病毒抗血清中和，病毒均能被高免血清特异性中和；而与等量猪细小病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒抗血清中和组，细胞呈现明显的细胞病变，可见该病毒特异性好。该毒株制备的疫苗免疫BALB/C小鼠后，能降低小鼠的死亡率。实施例2：重组猪伪狂犬病毒TK基因缺失株的构建从分离的猪伪狂犬病病毒(CGMCCNo.10266)中提取该分离株的DNA，采用基因工程的方法对该分离株进行毒力基因TK基因的缺失，并在细胞上进行拯救后命名为PRV/TK-，繁毒，加入保护剂后作为种子毒。具体实施方式如下：1PCR引物参考PRV全基因组序列(BK001744),自行合成系列引物,分别用来扩增TK基因左右同源臂，以及扩增EGFP和EGFP真核表达盒,以及用于鉴定TK基因缺失的引物。引物序列及预期PCR产物的大小见表1。表1：本研究中用到的引物2TK基因转移载体的构建以PRVQD株基因组为模板，利用引物TKLF/TKLR和TKRF/TKRR，分别扩增出位于TK两侧的序列(含部分TK基因)作为左右重组臂TKL、TKR，其中TKL、TKR的一端分别带有一个loxP位点。将其克隆到pMD19-T后对其进行PCR和酶切鉴定，鉴定正确后测序，对测序正确的阳性克隆T-TKL采用HindIII和PstI进行双酶切，将该片段克隆到同样酶切处理的pBluescriptSK载体上，鉴定正确后采用SpeI和XbaI分别对该重组质粒和连有右侧同源臂的重组质粒载体进行双酶切，分别回收含有左侧同源臂的线性化重组质粒和右侧同源臂，将二者进行连接。PCR和酶切进行鉴定。鉴定正确后送测序，测序结果正确的命名为pSKTKLR。以pCDNA3.1-EGFP质粒为模板，采用引物EorfF/EorfR扩增EGFP阅读框，连入真核表达载体pVAX1，鉴定正确后采用引物cassetteF/cassetteR扩增出含有EGFP的真核表达盒，连入pMD19-T载体，鉴定正确后命名为pMDEV。采用PstI和SpeI对pMDEV进行双酶切，回收真核表达盒，连入同样双酶切的pSKTKLR，鉴定正确后即为TK基因转移载体，命名为pSKTK-EGFP。3TK基因单缺失株病毒的构建及纯化拯救3.1转染重组病毒拯救在六孔细胞培养板上进行，待Vero细胞长满90％时进行转染。取PRVQD株基因组3μg，与1μg转移质粒pSKTK-EGFP混合后，按常规方法共转染，详细方法参见LipofectamineTM2000说明书。同时设仅含转移质粒的对照组。3.2鉴定PRVQD株基因组与pSKTK-EGFP共转染48h后，观察转染细胞病变形成情况及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功。重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/EGFP。3.3单缺失株报告基因的剔除利用Cre-loxP系统介导的位点特异性重组技术剔除报告基因EGFP。取10μg经Cre酶处理过的DNA，采用磷酸钙方法转染Vero细胞，置37℃CO2培养箱中培养2-3d，待细胞产生80％病变时收获病毒液。将病毒液反复冻融三次后取上清，按2uL/孔接种于24孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪伪狂犬病疫苗，其特征在于，所述的疫苗由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有由保藏编号为CGMCC No.10266的猪伪狂犬病病毒株进行毒力基因缺失后制成的减毒病毒株。

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病疫苗，其特征在于，所述的疫苗由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有由保藏编号为CGMCCNo.10266的猪伪狂犬病病毒株进行毒力基因缺失后制成的减毒病毒株；所述的毒力基因为TK基因。2.如权利要求1所述的猪伪狂犬病疫苗，其特征在于，所述的保护剂为病毒疫苗用保护剂。3.如权利要求2所述的猪伪狂犬病疫苗，其特征在于，所述的保护剂为蔗糖和明胶的水溶液。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：李明义，刘杉杉，孙伟，刘阳，李晓林，赵航，李彦凤，葛栋，李佳琪，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37