本发明专利技术公开了一种检测PDGFRA基因D842V多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，其中包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列；试剂盒具有检测简单、快速、准确、廉价等优点，为科研和临床PDGFRA基因D842V多态性位点分析提供了强有力的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测roGFRA基因D842V多 态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，用于TOGFRA基因D842V多态性位点的快速检测。
技术介绍
血小板衍生生长因子（PDGF)是一种促血管生成因子，H)GF是多种间质细胞如成 纤维细胞、血管平滑肌细胞、肾小球血管细胞、神经胶质细胞、内皮细胞等的强效促有丝分 裂原和重要的血管生长因子，由血小板，组织细胞和某些肿瘤细胞产生。血小板衍生生长因 子受体（PDGFR)是一种受体酪氨酸蛋白激酶家族成员，能够促进细胞的趋化、分裂与增殖， 在机体生长发育、创伤修复等生理过程中起积极重要的作用，并与肿瘤的发生密切相关。 TOGFRA是TOGFR的一种，在促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及血管生成等方面发挥重要作用。 TOGFR通路的激活涉及关键的下游信号通路，包括RAS-MAPK途径和PI3K途径等。TOGFRA基因由人类第4号染色体基因编码（4ql2)，TOGFRA基因全长约65kb，由 23个外显子组成，其中外显子3~10编码胞外的5个免疫球蛋白样区域，外显子11编码 跨膜区，外显子13~15和外显子17~21分别编码胞内的2个酪氨酸激酶区。TOGFRA基 因编码的蛋白质是血小板衍生生长因子受体a (platelet2derivedgrowthfactorrecep toralpha，TOGFRA)，TOGFRA为一种单链跨膜糖蛋白，由1089个氨基酸组成，593~954位 属于酪氨酸激酶区。 I^DGFRA基因突变常发生于12号外显子和18号外显子。伊马替尼（格列卫， Gleevec)作用于TOGFR下游的酪氨酸激酶，临床研宄显示伊马替尼用于治疗胃肠道间质 瘤、脑瘤和黑色素瘤效果显著，但TOGFRA基因外显子18的D842V突变会导致胃肠道间质瘤 患者对伊马替尼原发耐药。胃肠道间质瘤患者中约7%的病例携带TOGFR基因突变，其中 1/3病例有TOGFRA突变，突变主要发生在编码活性结构域的外显子18上，且TOFGR a基因 突变与C-KIT基因突变是相互独立的。选择靶向药物治疗癌症的患者应进行该基因的突变 检测，以帮助医生了解患者是否会对单抗类药物产生耐药性。 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-TaqmanMGB(MinorGrooveBinder)探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见。 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。 4)PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见〇 5)PCR-TaqmanMGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（WuDY,UgozzoliL,PalBK,WallaceRB.，ProcNatlAcad SciUSA1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen,X.，andSullivan,PF,ThePharmacogeonomics Journal2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（AyyadevaraS,Thaden JJ,ShmooklerReisRJ.,AnalBiochem2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct(Cyclethreshold)不同而已，因此就引入了ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要ACt值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，ACt值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见〇 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR(Competitive allelespecificTaqmanPCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见。有人采用锁 核酸（LNA) (PlantMethod2007, 3 :2)或修饰的碱基（AnalBiochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测PDGFRA基因D842V多态性位点的引物，其特征在于，所述引物包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高劲松，张英杰，李星颐，王箫笛，魏潇，魏奇，
申请(专利权)人：沈阳优吉诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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