一种检测小鹅瘟抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用，本发明专利技术属于生物技术检测领域，本发明专利技术包括包被抗小鹅瘟病毒(GPV)单克隆抗体的酶标板、GPV标准阳性抗原和针对GPV不同表位的酶标记抗GPV单克隆抗体。本发明专利技术的技术原理：酶联免疫吸附试验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。本发明专利技术可用于检测大分子抗原或特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、易于标准化等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及检测鹅细小病毒的试剂盒。
技术介绍
鹅细小病毒（Goose Parvovirus, GPV)即小鹅瘟病毒，鹅细小病毒感染是由鹅细 小病毒引起的一种高度接触性、急性、败血性传染病，主要侵害4周龄以内雏鹅和雏番鸭。 传染性强且死亡率高。雏鹅和雏番鸭以心肌炎、伪膜性肠炎、全身急性败血病变为特征。目 前，此病每年都有不同程度地流行，仍为养鹅业和集约化养殖番鸭的国家中最主要的传染 病之一，对水禽养殖业造成严重损失。1956年，我国学者方定一在江苏扬州首先发现了此 病，并用鹅胚分离出世界上第一株GPV。 目前虽然有不少的检测方法，例如琼脂扩散试验和琼脂扩散抑制试验，中和试验 和动物保护试验，直接免疫荧光诊断法，免疫酶斑点法（Dot-ELISA)，但是在一些基层单位 缺乏相应的实验设备无法在第一时间进行诊断从而造成很大的损失。
技术实现思路
本专利技术目的是提出一种能够快速、准确地检测GPV抗原，具有良好的特异性和较 高灵敏性的检测小鹅瘟抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒。 本专利技术包括包被抗小鹅瘟病毒（GPV)单克隆抗体的酶标板、GPV标准阳性抗原和 针对GPV不同表位的酶标记抗GPV单克隆抗体。 本专利技术的技术原理：酶联免疫吸附试验（ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在 固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分 子抗原或特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、易于标准化等优点。 本专利技术采用抗原与抗体的特异反应使待测物与酶标记物结合，然后通过酶与底物 产生颜色反应，用于定性和定量测定。 本专利技术测定的对象是GPV抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的 抗体(免疫吸附剂）②酶标记的抗体(标记物）③酶作用的底物(显色剂)。 测量时，一种抗体先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，当与相应抗原相 遇，即发生特异性结合，使抗原也保留在固相载体上，然后加另一种抗体酶偶联物(标记 物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原反应结合后， 再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。 其所生成的颜色深浅与欲测的抗原含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显 微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。其方法简单，方便讯速，特 异性强。 本专利技术GPV标准阳性抗原是用GPV毒株细胞培养物经纯化提取并灭活制得。 本专利技术包被在酶标板的抗GPV单克隆抗体为保藏号CGMCC No. 9578的杂交瘤细胞 株GPV-Mab-4E7分泌获得，酶标记抗GPV单克隆抗体为保藏号CGMCC No. 9577杂交瘤细胞 株GPV-Mab-6D8分泌获得。 本专利技术中杂交瘤细胞株6?￥-1&113-608于2014年8月26日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研宄所），保藏编号为CGMCC No. 9577。 本专利技术中杂交瘤细胞株GPV-Mab-4E72014年8月26日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研宄所），保藏编号为CGMCC No. 9578。 本专利技术应用两株抗GPV的特异性单克隆抗体4E7和6D8研制了 GPV ELISA检测试 剂盒，两株单克隆抗体与目前所有分离GPV毒株均具有良好的反应性。其腹水效价均可达 1:512000或以上，且分泌抗体的杂交瘤细胞株活性稳定。该试剂盒利用针对GPV不同表位 单克隆抗体使其可以直接检测GPV感染的鹅组织，GPV感染的鹅胚尿囊液，泄殖腔棉试子， 且检测的结果与PCR的符合率达到95%以上，与小鹅瘟组织中病毒分离符合率达到100%，灵 敏度高，能检测到的最低抗原量为〇. 05 μ g/mL。 本专利技术还有一个重要的环节就是需要高纯度的酶标记抗体，优质的酶标记抗体既 能保留抗体的免疫学活性，又能保留酶的活性。抗体的标记效率越高，则方法的敏感性越 高，所以这就需要摸索出比较成熟的HRP标记抗体的方法。本专利技术利用Thermo公司的加强 型活化过氧化物酶及标记试剂盒对单克隆抗体GPV-Mab-6D8进行标记，这有效地保证了本 方法的高敏感性。 本专利技术所述酶标记抗GPV单克隆抗体的标记酶是辣根过氧化物酶。利用Thermo 公司的加强型活化过氧化物酶及标记试剂盒对单克隆抗体GPV-Mab-6D8进行酶标，操作按 照试剂盒说明进行，具体步骤如下： (1) 准备I. 0~L 2mg纯化单克隆抗体IgG溶解到体积为1.0 mL的0· OlM PBS中； (2) 用IOOmL的ddw将Img的加强型活化过氧化物酶溶解，然后再加入上述单抗IgG ; (3) 立即加入IOuL硼氢化钠混匀后，室温作用Ih ; (4) 然后加入20uL终止缓冲液，混匀，室温作用15min; (5) 将标记好的单抗IgG按照Protein G柱纯化的步骤进行纯化，除去未结合的HRP， 测定浓度，分装保存； (6) 如需长久保存(如冻干保存)，需加终浓度为1%的BSA。 此外，本专利技术试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：稀释液、10X洗涤液、底物 缓冲液、TMB粉剂、TMB溶解液、双氧水溶液、终止液、阳性对照、阴性对照。 本专利技术另一目的是提出检测小鹅瘟抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒的应用，即检 测小鹅瘟抗原的方法，包括以下内容： 1、泄殖腔拭子：将泄殖腔拭子加到Iml稀释液中，反复冻融两次，检测前，将样品恢复 至室温（18-25°C )，让杂质沉淀下来。细胞适应毒：破碎细胞，直接取样。新鲜组织病料用 PBST等体积稀释，破碎离心取上清。鹅胚尿囊液可以作为抗原样本直接检测。 2、将待检样品各取100ul，分别加入酶标板各孔中。37°C温育1. 5小时，然后用 PBS-T洗涤3次。 3、每孔加入IOOul酶标记的单克隆抗体，37°C温育1小时，然后用PBS-T洗涤5次。 4、每孔加入IOOul底物溶液，显色15分钟，再分别加50ul终止液，终止反应。测 定0D450值。 本专利技术方法简单，易于操作，检测全程用时只需3小时，可检测感染GPV的小鹅肝 脏、脾脏、肠道组织中的GPV，以及鹅胚分离培养和细胞培养物中的GPV。其检测的结果与 PCR的符合率达到95%，与小鹅瘟组织病毒分离符合率达到100%，可以检测GPV感染的鹅组 织、病鹅泄殖腔棉试、GPV感染的鹅胚尿囊液和细胞培养的GPV等。 本专利技术适用于基层各级兽医部门、大型养殖企业和出入境部门的快速大量检测。 该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。【附图说明】 图1为单克隆抗体GPV-Mab-6D8、GPV-Mab-4E7分别与阳性尿囊液和阴性尿囊液的 免疫印迹鉴定显影条带图。 图2为单克隆抗体的间接免疫灰光鉴定图。 图3为当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测小鹅瘟病毒抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括包被抗GPV单克隆抗体的酶标板、GPV标准阳性抗原和针对小鹅瘟病毒不同表位的酶标记抗GPV单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：秦爱建，钱琨，石亚运，郭卉，宋娜，邵红霞，叶建强，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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