本发明专利技术涉及干细胞培养领域，尤其涉及Y-27632在间充质干细胞培养中的应用及间充质干细胞的培养方法。本发明专利技术提供了Y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的应用。本发明专利技术通过实验证实，相同培养条件下，培养基中添加Y-27632能够促进间充质干细胞的增殖，本发明专利技术还提供了培养间充质干细胞的培养基和培养方法，实验表明，经培养五代后，与未添加Y-27632的对照组相比，添加Y-27632的实验组中，脐带间充质干细胞的数量提高31.87％；羊膜间充质干细胞的数量提高30％，骨髓间充质干细胞的数量提高27.27％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞培养领域，尤其涉及Y-27632在间充质干细胞培养中的应用及 间充质干细胞的培养方法。
技术介绍
ROCK信号通路抑制剂Y-27632的CASNO.为146986-50-7，分子式为 C14H21N30 ?HC1，相对分子量为320. 3,是一种高效的Rho相关的卷曲蛋白形成丝氨酸-苏 氨酸蛋白激酶（ROCK)家族的小分子特异性抑制剂，能选择性的抑制R0CKl(pl60R0CK)和 R0CK2,IC5(I (半数有效浓度）值分别为140nmol和800nmol;并且，Y-27632也抑制PRK2,其 IC5(I为600nmol/L。其抑制作用是通过与ATP竞争结合催化位点来实现的.现有技术表明， Y-27632的功能主要包括以下几个方面：1、选择性的抑制平滑肌钙离子敏感性并阻断其收 缩，阻止Rho诱导的、pl60R0CK介导的细胞张力纤维的形成；2、降低几种高血压大鼠模型的 血压；3、保护艾氏腹水癌小鼠免于肿瘤的形成；4、阻止肝癌肝内转移。 人间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSC)是具有明显可塑性和多向分化 潜能的一种成体干细胞，在不同生长因子的调节下，可分化成来源于3个胚层的不同组织 细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、肝样细胞、心肌样细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰 岛样细胞等。除此，人间充质干细胞不表达主要组织相容性II类抗原，微量表达主要组织 相容性I类抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫调节功效，移植后的人羊膜 间充质干细胞分泌的营养因子，具有促血管生成、促细胞生长、抗炎症和抗纤维化等作用， 在干细胞治疗、组织工程治疗和再生医学研宄应用中具有重要意义。 人间充质干细胞存在于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊 水、脐带血中。目前，骨髓间充质干细胞的应用最为广泛。不同来源的干细胞的生物学特征 存在相似之处，例如，都成纤维样形态生长，具有强大的体外扩增能力，都能像不同的组织 分化。但是，不同来源的干细胞之间生物学特征还存在着差异：骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cell, BMMSC)志物 除表达间充质干细胞表面标志物、整合素家族。人羊膜间充质干细胞（humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)，来 源于胎盘的羊膜组织的间质层，形态学类似于骨髓间充质干细胞。hAMSC的表面标志物除 表达间充质干细胞表面标志物、整合素家族外，还表达胚胎干细胞类的表面标志物，这些因 子的阳性表达说明hAMSC的增殖能力比MMSC要强。hAMSC不表达HLA-DR、⑶14,弱表达 HLA-ABC，且不表达共刺激银子，⑶80、⑶83、⑶86、⑶40L，这表明hAMSC具有较低的免疫原 性。且研宄表明，hAMSC能表达多种比骨髓源MSC表达更丰富的造血细胞因子，例如：IL3细 胞因子。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesnchymal stem cells，MSCs) 是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比 骨髓MSCs低。研宄表明，分离后的脐带血淋巴细胞和单核细胞百分比分别为60. 56 %和 17. 93%，明显多于骨髓血46. 75%和10. 70%。分离后脐血干细胞的⑶34、⑶38明显多于 骨髓血干细胞，分别为5. 7:1. 6和2. 4:1. 6。目前对人MSC的培养基主要采用基础培养基（如DMEM/F12)联合胎牛血清（FBS)， 但存在细胞增殖速度慢的特性。并且，异源血清的食用存在污染外源病毒和致病因子的风 险。因此，进一步开发不采用异源血清而能保证细胞增殖速度和干性的培养方法十分必要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供Y-27632在间充质干细胞培养中的 应用及间充质干细胞的培养方法，本专利技术提供的方法不采用异源血清，而使用Y-27632促 进MSC的增殖，从而实现在无血清条件下MSC的快速稳定增殖，且能够保持良好的干性。 本专利技术提供了y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的应用。 本专利技术通过实验证实，相同培养条件下，培养基中添加Y-27632能够促进间充质 干细胞的增殖，实验表明，经培养五代后，与未添加Y-27632的对照组相比，添加Y-27632的 实验组中，脐带间充质干细胞的数量提高31. 87% ;羊膜间充质干细胞的数量提高30%，骨 髓间充质干细胞的数量提高27. 27%。 在本专利技术的实施例中，间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细 胞或人羊膜间充质干细胞。 在本专利技术的实施例中，Y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的剂量为Ing/mL~ 100ng/mL〇 在一些实施例中，Y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的剂量为10ng/mL。 本专利技术提供的实施例表明，采用lg/mL~100g/mL的Y-27632作为间充质干细胞 增殖促进剂能够很好的促进间充质干细胞的增殖，但当浓度达到lOnmol/mL时，虽然仍能 起到促进细胞增殖的作用，但细胞的干性出现下降。 因此，本专利技术还提供了一种间充质干细胞的培养基，包括lonza完全培养基和 Y-27632 ;Y-27632 的浓度为Ing/mL~100ng/mL。 在一些实施例中，本专利技术提供的间充质干细胞的培养基中Y-27632的浓度为 lOng/mLolonza完全培养基是一种一样丰富的无血清培养基，其中以无血清培养基Lonza UltraCULTURETM为基质，添加血清替代物PALLUltroserG。能够给细胞提供丰富的营养， 使细胞快速、稳定增长。 本专利技术还提供了一种间充质干细胞的培养方法，包括：将原代间充质干细胞接种 于本专利技术提供的培养基中，经培养获得P1代间充质干细胞后传代。 在本专利技术的实施例中，接种的密度为5000个/cm2。 在本专利技术的实施例中，培养的条件为37°C，5%C02,95%湿度。 在本专利技术的实施例中，培养的时间为3天。 在本专利技术的实施例中，传代的次数为5次。 经传代5次，细胞数量能够达到1. 2X107。能够满足大部分常规实验的要求。若 仍需更大量的细胞数量，可进一步传代培养，通常经传代10代，细胞仍保持良好的干性及 旺盛的增殖能力。 在本专利技术的实施例中，间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细 胞或人羊膜间充质干细胞。 本专利技术提供了Y-27632作为间充质干细胞增殖促进剂的应用。本专利技术通过实验证 实，相同培养条件下，培养基中添加Y-27632能够促进间充质干细胞的增殖，本专利技术还提供 了培养间充质干细胞的培养基和培养方法，实验表明，经培养五代后，与未添加Y-27632的 对照组相比，添加Y-27632的实验组中，脐带间充质干细胞的数量提高31. 87%;羊膜间充 质干细胞的数量提高30%，骨髓间充质干细胞的数量提高27. 27%。【附图说明】 图l_a示采用培养基1培养脐带MSC5代后的的流式检测图； 图l_b示采用培养基3培养脐带MSC5代后的的流式检测图； 图1-c示采用培养基1培养脐带MSC10本文档来自技高网...
【技术保护点】
Y‑27632作为间充质干细胞增殖促进剂的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，陈海佳，葛啸虎，黎娟妹，王小燕，李平，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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